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鸡贫血病毒VP3基因与人IL-18基因的共表达对人肝癌细胞BEL-7402的作用
目的利用凋亡素和IL-18基因的抗肿瘤优势,设计构建共表达凋亡素和hIL-18基因的真核重组子,检测其在体外对人肝癌细胞BEL-7402的作用效果,旨在探索新的肿瘤基因治疗方法.方法将凋亡素VP3基因与hIL-18基因一同克隆到真核表达载体pVAX1上,构建重组质粒pVVP3IL-18,经脂质体介导,转染人肝癌细胞BEL-7402,AO/EB染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化,透射电镜分析凋亡细胞超微结构变化.结果随着转染时间的延长,重组质粒pVVP3IL-18所表达的目的蛋白对BEL-7402细胞的杀伤作用逐渐增强,作用48 h,形态学观察表明BEL-7402细胞发生明显的凋亡,凋亡率可达(56.5±11.9)%,并且大部分细胞为TUNEL阳性着色,流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰,透射电镜观察可见细胞核固缩、染色质聚集等典型的凋亡超微结构变化.结论联合应用凋亡素与hIL-18基因,在体外对人肝癌细胞BEL-7402具有明显的凋亡诱导作用.
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转入IL-18 cDNA的鼻咽癌细胞在hu-PBL-SCID鼠中致瘤性的影响
为了探讨人白细胞介素18(hIL-18)的表达对鼻咽癌细胞体内致瘤性的影响,我们构建了hIL-18的真核表达载体pcD-NA3/hIL-18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE细胞;然后以转染阳性的SUNE细胞和未转染的SUNE细胞接种到用健康人外周血白细胞免疫重建的SCID鼠(hu-PBL-SCID鼠),观察成瘤情况.结果发现,所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL-18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL-18的含量为(85±10)p∥ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL-18的含量低于5 pg/ml.将转染阳性的细胞克隆和未转染的SUNE细胞接种hu-PBL-SCID小鼠后连续观察50 d,发现前者形成的肿瘤其生长速度明显慢于后者,其平均瘤重也有显著性差异(P＜0.001).说明在体内hIL-18的表达能有效地抑制鼻咽癌细胞的成瘤作用.
关键词： 人白细胞介素18 真核表达载体 鼻咽癌 致瘤性 Hu-PBL-SCID鼠 -
人白细胞介素18基因化学合成及其在大肠杆菌中高表达
目的设计并合成人白细胞介素18(hIL-18)基因,在大肠杆菌T7表达系统中高表达hIL-18.方法根据大肠杆菌的偏爱密码子和翻译起始区的二级结构,设计并人工合成了hIL-18的基因.将新合成基因克隆到载体pMFT7-5,经转化JM109(DE3),得到工程菌JTI.结果经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明目的蛋白质占总蛋白质的30%,具有免疫学活性.结论实现hIL基因在大肠杆菌中的高效表达.
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抗肿瘤和乙肝双效IL18-HBV S基因疫苗的构建
[目的]探讨IL-18及乙肝病毒s基因(HBV s)的联合功效。[方法]从胎肝组织中抽提总RNA，RT-PCR扩增IL-18cDNA基因。从载体pcDNA3.0/S中限制性酶切获取HBV S基因，然后，将其与IL—18 cDNA一并亚克隆到真核表达质粒pIRES—EGFP中。[结果]构建了具有抗肿瘤及乙肝双重功效的IL18-HBV S乙肝基因疫苗。[结论]含有IL-18基因的HBv基因疫苗的构建为基因疫苗的功能和应用研究提供了基础。
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人白介素18(IL-18)插入突变体抗血管新生作用的研究
目的构建IL-18的定点突变体,并研究其对血管新生的抑制作用.方法利用基因重叠延伸剪接技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入一个GGC序列,使IL-18第39位精氨酸和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体.将此cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并在酵母Pichia Pastoris GS115中得到高效表达.结果IL-18-RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力外,对ECV304细胞的增殖(IC50=7.80μmol/L)和对ECV304向Fn的黏附均具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖关系;而野生型IL-18对ECV304细胞向Fn的黏附则没有作用.结论与野生型IL-18相比,IL-18-RGD增加了抗血管生成作用,从而增强其抗肿瘤能力.
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人白细胞介素18对肺癌A549细胞生物学功能的影响
目的：探讨人白细胞介素18（interleukin 18，IL-18）对肺癌A549细胞生物学功能的影响。方法将IL-18重组质粒及其空载对照质粒转染肺癌A549细胞，用抗生素加压筛选阳性细胞，构建稳定表达IL-18质粒及空载质粒的肺癌细胞，将构建好的稳定过表达IL-18细胞和空载对照细胞分别命名为IL18-A549细胞和NC-A549细胞。采用细胞计数法、流式细胞术、划痕实验和transwell迁移、侵袭实验检测IL-18过表达对肺癌A549细胞增殖、凋亡、运动、迁移和侵袭能力的影响。结果成功构建稳定过表达IL-18肺癌细胞IL18-A549。与空载对照细胞NC-A549相比，过表达IL-18可促进肺癌A549细胞增殖（P约0.05），但对细胞早期、晚期及总凋亡率无明显影响（P跃0.05）。IL18-A549细胞的划痕愈合率为（62.0依5.7）%，高于NC-A549细胞的（31.2依3.7）%，两者比较差异有统计学意义（P约0.05）；IL18-A549细胞和NC-A549细胞发生迁移的细胞数目平均为48个和9个，发生侵袭的细胞数目平均为33个和11个，两者差异均有统计学意义（P均约0.05）。结论过表达IL-18可促进肺癌A549细胞增殖、运动、迁移和侵袭，IL-18可能是肺癌转移过程中的关键因子。
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重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达
目的:构建人白介素18(hIL-18)真核表达载体, 在毕赤酵母中高效分泌表达hIL-18.方法:通过PCR法扩增得到hIL-18基因, 构建其真核表达载体pPICZaC/hIL-18, 电转化毕氏酵母X-33, PCR、 SDS-PAGE、 Western blot等方法筛选获得高效表达rhIL-18的工程菌株, 疏水层析和阴离子交换层析纯化表达产物, 并初步测定其生物学活性.结果:rhIL-18经甲醇诱导后其表达产量约为202 mg/L.Western blot检测了rhIL-18的特异性结合活性; rhIl-18纯化后纯度达95%左右, 并证明rhIL-18能够协同IL-2诱导PBMC分泌IFN-γ.结论:构建了重组hIL-18的基因工程菌, 并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达, 为进一步研究其活性和功能奠定了基础.
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人白细胞介素18 cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达
血管生长素angiogenin, ANG)是一种能有效促进新生血管形成的刺激因子[1],在新生血管的形成过程中发挥着重要的作用.而新生血管的形成又是体内实体瘤生长和转移必不可少的重要环节.已有大量研究表明,ANG与肿瘤的快速生长和转移具有密切的关系[2].因此,通过检测体内ANG 的水平变化,有望对相关肿瘤的发生和发展提供有效的实验依据.
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人IL-18克隆
从人外周血单核细胞中分离总RNA,进行RT-PCR获得人IL-18成熟编码序列cDNA,测序结果显示,所克隆的人IL-18cDNA编码序列与GenBank所报道的序列完全一致.本研究结果为进一步探讨IL-18的生物学活性和特性奠定了基础,同时亦为利用IL-18进行免疫基因治疗打下了良好的基础.
