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同型半胱氨酸诱导ECV304细胞氧化损伤研究
探讨同型半胱氨酸(Hcy)诱导人脐带静脉内皮细胞株--ECV304细胞氧化损伤的机制.用含不同剂量Hcy(0.05-2.00mmol/L)的培养基培养细胞12小时以后,以分光光度比色法分别测定细胞内丙二醛含量和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活力的改变.以荧光显色法测定细胞内活性氧产生的改变.结果表明小剂量(0.05～0.10mmol/L)Hcy可明显的促进氧化损伤,促使细胞内MDA含量增加和细胞内活性氧的产生,并显著降低细胞内除过氧化氢酶以外的其它抗氧化酶(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的活性.结论认为Hcy可能通过诱导细胞氧化损伤而损害血管内皮细胞.
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异甘草素与光甘草定抗肿瘤转移作用比较
目的:观察异甘草素和光甘草定对肿瘤细胞体外迁移能力以及血管内皮细胞管腔形成能力的影响,比较2种药物的抗肿瘤转移能力.方法:以20,40,60,80,100,120μmol·L-异甘草素和光甘草定作用于小鼠黑色素瘤B16F1细胞和血管内皮细胞(ECV304),干预48 h,磺酰罗丹明B(SRB)法检测细胞增殖.划痕实验评价B16F1和ECV304细胞体外迁移能力,明胶酶电泳和酶联免疫法(ELISA)测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活性和表达量,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色以及血管内皮细胞管腔样结构形成实验评价血管新生能力.结果:异甘草素和光甘草定均能显著抑制B16F1细胞和ECV304细胞增殖,且呈明显的剂量依赖性,但光甘草定对B16F1细胞的抑制率低于异甘草素.80 μmol·L-时,异甘草素与光甘草定的愈合面积分别为19.1％和27.2％,与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05),药物组与对照组相比均能降低基质金属蛋白酶-2(MM P-2)分泌与表达,药物组能显著降低血管内皮细胞迁移和管腔形成能力.光甘草定对B16F1细胞迁移,MMP-2分泌与表达,以及对ECV304细胞官腔形成的抑制能力低于异甘草素.结论:异甘草素和光甘草定都均具有抗肿瘤转移活性,80μmol·L-时,光甘草定抗肿瘤转移作用弱于异甘草素.
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VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究
本研究探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤(MM)基因治疗的可行性.将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIPES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF,酶切、测序鉴定.用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266,G418筛选获得阳性克隆.RT-PCR、Western blot法分别检测阳性克隆中VEGF mRNA和蛋白的表达;利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化;利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成.结果表明:获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF;VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达,转染重组质粒的U266细胞VEGF mRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少,细胞的增殖受到抑制,凋亡增加.转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少.结论:VEGF反义RNA可以下调VEGF表达,从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖,增加其凋亡并抑制血管形成.
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肿瘤坏死因子α和雷公藤内酯醇调节Raji细胞内VEGF的表达及基质胶中ECV304细胞血管形成作用的研究
为了探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)和雷公藤内酯醇作用Raji细胞VEGF(血管内皮细胞生长因子)的表达及VEGF与ECV血管形成的关系,采用MTT法检测雷公藤内酯醇抑制Raji细胞增殖的影响;用ELISA法对Raji细胞上清的VEGF定量;用基质胶上的内皮细胞网络形成检测ECV304(人类脐静脉内皮细胞起源的细胞系)血管生成;用RT-PCR检测VEGF mRNA含量.结果表明:雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖方式,适合作用时间为24小时,24小时半数抑制浓度IC50为25 nmol/L;Raji细胞上清VEGF的含量在TNF-α组明显高于空白对照组,雷公藤内酯醇处理组则明显低于空白对照组,两者比较有极显著差异(P＜0.01);Raji细胞内VEGF mRNA主要为VEGFi65和VEGF121,其含量在TNF-α处理组与空白对照组比较有增加,而雷公藤内酯醇抑制VEGF mRNA表达,并呈剂量依赖方式;Raji细胞上清、VEGF(10 ng/ml)和TNF-α(10 ng/m1)处理的Raji细胞上清在基质胶中作用ECV304细胞后可促进血管形成,而雷公藤内酯醇(25 nmol/L)处理的Raji细胞上清和1640培养基作为的对照组加入基质胶中ECV304细胞未见血管形成.结论:在TNF-α、雷公藤内酯醇作用Raji细胞过程中,TNF-α促进VEGF的表达而雷公藤内酯醇则抑制其表达;TNF-α处理的Raji细胞上清在基质胶中促进血管形成,而雷公藤内酯醇则抑制血管形成.
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人参皂苷IH901对ECV304细胞增殖和迁移的影响及其分子机制
本文探讨人参皂苷20-O-(β-D-吡喃葡萄糖)-20(S)-原人参二醇皂苷(IH901)对ECV304细胞的增殖和迁移的抑制作用.以不同浓度的IH901体外作用ECV304细胞.采用MTT法检测IH901对ECV304细胞生长的抑制效果和对基质黏附能力的影响,显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率,划痕法检测细胞的迁移能力,ELISA检测试剂盒检测VEGF和bFGF在ECV304细胞中的表达,Western blotting检测被激活的cleaved caspase-9和cleaved caspase-3两种蛋白的表达量.结果表明.人参皂苷IH901可能通过抑制ECV304细胞分泌VEGF和bFGF,并上调促凋亡蛋白cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达,从而使得细胞被阻滞在G0/G1期,并且在形态学上观察到典型的细胞凋亡变化,如细胞皱缩,体积变小,伴随核固缩,终导致人参皂苷IH901对ECV304细胞与细胞外基质黏附能力和细胞迁移能力有明显的抑制作用,且呈时间和浓度依赖关系.
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白藜芦醇和紫檀芪体外抗肿瘤转移作用
目的 比较白藜芦醇和紫檀芪体外抗肿瘤转移作用.方法 白藜芦醇和紫檀芪5～50 μmol·L-1分别与小鼠黑色素瘤细胞B16 F1和内皮细胞ECV304作用48 h,再分别用磺基罗丹明B染色法测定细胞增殖率.白藜芦醇和紫檀芪10 μmol· L-1与细胞作用48 h,用划痕实验评价B16F1和ECV304细胞体外迁移能力,用明胶酶电泳和ELISA测定B16F1细胞分泌基质金属蛋白酶2(MMP-2)的活性和含量.用重建基底膜法观察白藜芦醇和紫檀芪10 μmol· L-1作用24 h对ECV304细胞拟管腔形成的抑制作用.结果 白藜芦醇和紫檀芪作用48 h均能显著抑制B16F1和ECV304细胞增殖,抑制B16F1细胞增殖的IC50分别为119.7 μmol·L-1和37.3 μmoI·L-1,抑制ECV304细胞增殖的IC50分别为72.2 μmol·L-1和37.2 μmol·L-1.白藜芦醇和紫檀芪10 μmol·L-1作用48 h,B16F1细胞愈合率分别为58.0％和36.8％,ECV304细胞愈合率分别为61.8％和28.9％,明显低于正常对照组的67.7％和88.4％(P＜0.01),而且紫檀芪组明显低于白藜芦醇组(P＜0.01).与正常对照组相比,白藜芦醇和紫檀芪10 μmo·L-1作用48 h使B16F1细胞MMP-2蛋白表达分别降低7.4％和13.9％(P＜0.01),MMP-2活性分别降低19.3％和78.9％(P＜0.01).白藜芦醇和紫檀芪作用24 h均可使ECV304细胞管腔样结构破坏,且紫檀芪的作用较白藜芦醇更加明显.结论 白藜芦醇和紫檀芪均具有抑制B16F1和ECV304细胞增殖和转移的作用,并能抑制ECV304细胞拟管腔形成;浓度为10 μmol· L-1时紫檀芪的抑制作用强于白藜芦醇.
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猪、熊胆粉主要成分对ECV304细胞缺氧损伤保护作用的比较
目的比较猪胆粉与熊胆粉中胆酸类主要成分对细胞缺氧损伤保护作用的差别,为猪胆粉替代熊胆粉用于中风病治疗提供实验依据.方法培养的ECV304细胞,用连二亚硫酸钠造成缺氧损伤,并分别以MTT比色法、LDH漏出率和台盼蓝染色法进行检测.比较猪胆粉与熊胆粉中胆酸类主要成分对细胞缺氧损伤保护作用的差别.结果应用连二亚硫酸钠造成ECV304细胞明显损伤,而猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸钠均使ECV304细胞的缺氧损伤明显减轻,与对照组间有显著差异,但三组间没有明显差别.结论猪去氧胆酸对ECV304细胞缺氧损伤具有与牛磺熊去氧胆酸相类似的保护效应,提示猪胆粉可替代价格昂贵的熊胆粉用于中风病的治疗.
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ECV304细胞二维培养形成毛细血管样结构的观察
目的观察ECV304细胞体外二维培养能否形成毛细血管样结构.方法采用自然转化的人脐静脉内皮细胞-ECV304细胞株,不用额外的生长因子,选择不同血清浓度的培养液等条件进行二维培养观察.结果ECV304细胞在不同条件下都能形成毛细血管样结构,低浓度血清更容易诱导内皮细胞迁移,形成毛细血管样结构.结论在二维培养时,ECV304细胞具有形成毛细血管样结构的能力,提示其可用作体外血管新生的内皮细胞研究工具.
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营养素防护同型半胱氨酸致ECV304细胞损伤和凋亡
目的:探讨叶酸、维生素E(VE)和硒(Se)对同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)诱导ECV304细胞损伤和凋亡的防护作用及其机制.方法: 采用倒置显微镜观察和MTT实验检测各种营养素对Hcy细胞损伤作用的防护,采用琼脂糖凝胶DNA电泳和流式细胞仪检测各种营养素对Hcy诱导细胞凋亡作用的防护.并通过测定细胞内脂质过氧化水平、细胞内抗氧化酶活力及对细胞内活性氧产生的改变研究其保护机制.结果: 叶酸、VE和Se都可防护Hcy的细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡作用,并都可明显减少细胞内MDA含量.叶酸可以明显增加细胞内SOD活力,叶酸和Se可以明显增加细胞内GSH-Px活力.VE对Hcy诱导的细胞内活性氧产生具有明显抑制作用,而Se和叶酸抑制作用不明显.结论: 叶酸、VE和Se都可以防护Hcy导致的细胞增殖抑制,并可以抑制Hcy诱导的细胞凋亡,但其作用机制不同.
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当归注射液有效成分的抗低氧保护作用
目的:研究梯度分离的当归注射液有效成分(5-HMF)对小鼠及体外培养的ECV304细胞的抗低氧保护作用.方法:观察常压低氧和低压低氧下小鼠存活时间;通过MTT比色法检测ECV304细胞经低氧后的细胞存活率、并以台盼蓝染色检测细胞死亡率来评价药效.结果:与低氧组比较,加药低氧后,小鼠存活时间延长(P<0.05);低氧后细胞存活率降低,死亡率升高,而加入当归注射液有效成分(5-HMF)处理的细胞存活率明显高于低氧对照组(P<0.01),死亡率亦明显降低(P<0.01).结论:当归注射液有效成分(5-HMF)对小鼠及体外培养的ECV304细胞均具有抗低氧保护作用.
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哇巴因诱导ECV304细胞凋亡与p120ctn mRNA的表达
目的 研究哇巴因对ECV304细胞的作用及相关机制.方法 应用MTT法检测哇巴因对细胞生长抑制作用,Hoechst33342/PI双荧光染色分析细胞死亡特征,透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化,半定量RT-PCR法检测P120ctn 1A和P120ctn 3A mRNA的表达.结果 哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;荧光显微镜下可见30%以上细胞为凋亡细胞,20%细胞为晚期凋亡细胞的形态学改变;透射电镜下可见核染色质凝集、边移、凋亡小体形成等细胞形态学变化;RT-PCR结果显示P120ctn 1A mRNA表达较对照组明显降低,P120ctn 3A mRNA表达较对照组明显增强.结论 哇巴因能抑制ECV304细胞增殖和诱导其凋亡,并下调P120ctn 1A和上调P120ctn 3A mRNA表达.
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肌肽对ECV304细胞缺氧损伤的保护作用
目的 研究肌肽对缺氧所致人体内皮细胞系ECV304细胞损伤的影响.方法 建立缺氧条件下ECV304细胞损伤模型,用MTT法观察肌肽对缺氧损伤的ECV304细胞活性的影响,测定细胞培养基中乳酸脱氨酶(LDH)活力,并对细胞骨架进行考马斯亮蓝R-250染色观测其细胞结构.结果 浓度为10～20 mmol/L肌肽孵育ECV304细胞6 h后,可以抑制缺氧12 h和24 h引起的ECV304细胞活性下降,同时减少LDH的释放,保持细胞骨架完整.结论 肌肽对缺氧所致的ECV304细胞伤具有保护作用.
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β-细辛醚对Aβ痴呆损伤过程中ECV304细胞黏附分子表达的影响
目的:了解Alzheimer's病中β-淀粉样蛋白沉积在血管内皮细胞给其造成的损伤,以及β-细辛醚对血管内皮细胞黏附分子表达的影响和对血管内皮细胞损伤修复的影响.方法:运用形态学、流式细胞术及MTT法,检测Aβ损伤、正常和β-细辛醚治疗的ECV304细胞的DNA周期,钙离子浓度及CD106,CD62P,CD62E这3种黏附分子表达的变化.结果:β-淀粉样蛋白在血管内皮细胞痴呆损伤过程中,上调其他3种黏性分子和钙离子浓度,造成细胞凋亡;β-细辛醚能下调3种黏性分子的表达和钙离子浓度,减少细胞凋亡.结论:β-细辛醚通过调节某些外周血小板黏附分子和血管间黏附分子和钙离子浓度,减轻β-淀粉样蛋白对血管内皮细胞的痴呆损伤.
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钠泵抑制剂哇巴因对ECV304细胞连接相关分子表达的影响
目的:探讨钠泵抑制剂哇巴因对细胞连接相关分子表达的影响.方法:以不同浓度哇巴因作用ECV304细胞,用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态变化;通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长抑制作用;用Hoechst33342/PI双荧光染色、荧光显微镜分析细胞死亡特征;应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞连接相关分子钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白、 P120连环蛋白1A和P120连环蛋白3A mRNA的表达.结果:哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;10 μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死;0.1 μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、边移、凋亡小体形成等凋亡特征.RT-PCR结果显示钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白和P120连环蛋白1A表达下降,P120连环蛋白3A表达上调.结论:哇巴因调节ECV304细胞连接相关分子表达从而影响其黏附和存活.
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分泌人可溶性FL基因转染细胞及其生物学活性分析
应用基因重组技术构建了人可溶性FL基因逆转录病毒载体pLXSN-FL,经转染PA317细胞和G418筛选抗性细胞克隆,获得重组病毒液.NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,选择适当滴度的重组病毒(5×105CFU/m1)感染ECV304细胞;应用聚合酶链反应(PCR)及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染ECV304细胞FL的DNA及mRNA表达;应用ELISA测定rhFL在ECV304中的表达水平,用荧光标记和流式细胞仪检测转基因上清对单个核细胞来源DC的表型影响及3H-TdR掺人法测定DC对T细胞的促增殖作用.结果表明,外源性rhFL基因整合到ECV304细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,稳定表达水平为82.4ng(106细胞/24 h)的人FL.转基因ECV细胞培养上清能有效诱导人PBMC来源DC的分化和增强DC对T细胞的激发作用.外源性FL基因可以转移到ECV304细胞并稳定表达,有助于体外研究内皮细胞与免疫细胞的相互作用.
关键词： Flt3配体(FL) 逆转录病毒载体 ECV304细胞 -
NF-κB/p65特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对p65表达的抑制效应
目的 构建NF-κB p65亚基特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体,并验证其对p65亚基的基因沉默效应.方法 设计合成三对针对p65 mRNA不同位点的短发夹RNA(shRNA)编码序列,克隆到穿梭载体中,通过体外同源重组将短干扰RNA(siRNA)表达盒转移到腺病毒骨架质粒,构建RNAi腺病毒表达载体;在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定;腺病毒感染人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞,Western印迹法和免疫细胞化学法验证构建的RNAi腺病毒对p65蛋白表达的抑制效应.结果 成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染ECV304细胞后可以高效抑制p65蛋白的表达,且对p65蛋白表达的抑制作用可持续6 d以上.结论 应用RNAi腺病毒表达载体能有效阻断目的基因的表达.
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PTEN抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖和VEGF的表达
目的:探讨与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tetsin hemology deleted on chromosome ten gene,PTEN)对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞增殖、凋亡,及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体1(VEGF receptor 1,VEGFR1)的影响.方法:将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒Ad-PTEN-GFP及空载体腺病毒Ad-GFP感染ECV304细胞,MTT实验、Hoechst3342染色法及流式细胞术检测ECV304细胞的增殖和凋亡.实时荧光定量PCR法检测Ad-PTEN -GFP感染后ECV304细胞中PTEN、VEGF和VEGFRI mRNA表达水平,ELISA检测ECV304细胞培养上清中VEGF的水平.鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管生长实验检测PTEN对鸡胚血管生长的影响.结果:与Ad-GFP相比,Ad-PTEN-GFP感染能明显抑制ECV304细胞的增殖,诱导细胞凋亡,5d时增殖抑制率可达(50.38±5.42)%、细胞凋亡率达(73.3±5.3)%.当感染复数为100时,Ad-PTENGFP组ECV304细胞的VEGF及VEGFR1 mRNA表达水平分别为未感染组的(13.40±1.32)%及(46.12±5.20)%.同时,Ad-PTEN-GFP感染能够明显抑制CAM体内血管生长[血管指数(57.6±3.37)% vs (92.2±4.37)%,P＜0.05].结论:PTEN能显著抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖、促进其凋亡,其机制可能与抑制VEGF和VEGFRI表达,抑制血管新生有关.
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大豆异黄酮对大鼠血脂的影响及其体内外抗氧化作用研究
目的: 观察大豆异黄酮(SI)对高脂饮食大鼠血脂、血液及肝脏丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)及肝脏脂肪病变的影响,以及其主要成分之一金雀异黄素对过氧化氢损伤的ECV304内皮细胞有无保护作用.方法:根据血清总胆固醇(TC)水平,50只雄性Wistar大鼠分为5组:正常对照、高脂饮食对照组和3个SI治疗组. 3个SI治疗组分别每日灌胃给予SI 30、60、120 mg/kg,对照组则给予相应的溶媒,持续9周.治疗第2、4、9周末,测定血清TC、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL).治疗结束时,测定红细胞和肝匀浆SOD活力,血清和肝匀浆MDA含量,并观察肝脏病理变化.以MTT法观察与不同浓度的金雀异黄素体外孵育一定时间后的ECV304内皮细胞对抗过氧化氢氧化损伤的能力.结果:SI 30、60、120 mg/kg 无改善血清TC、LDL、TG、HDL的作用,肝脏病理结果也与血脂结果相似.但是与高脂饮食对照组相比,大鼠红细胞及肝脏的SOD活力明显升高,而血清及肝脏MDA含量也有一定程度降低(P<0.01,P<0.05).对于过氧化氢引起ECV304细胞损伤,金雀异黄素25、50、100 μmol/L 有剂量依赖性保护作用.结论:大豆异黄酮不能改善高脂饮食大鼠的血脂,不能抑制其肝脏脂肪病变.但其有一定体内外抗氧化作用.
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维泰醇和紫杉醇抗肿瘤转移作用比较
目的 观察维泰醇和紫杉醇对肿瘤细胞体外迁移能力以及血管内皮细胞管腔形成能力的影响,对它们的抗肿瘤转移能力进行比较,以证实维泰醇的抗肿瘤血管新生及抗肿瘤转移作用.方法 采用SRB法,划痕试验,明胶酶谱法、ELISA、AO/EB染色法以及管腔样结构形成试验等方法观察比较维泰醇与紫杉醇的抗肿瘤转移能力.结果 维泰醇对黑色素瘤细胞(B16F1)生长抑制率和致死率低于紫杉醇,维泰醇对黑色素瘤细胞迁移、MMP-2表达和对血管内皮细胞(ECV304)管腔形成的抑制能力略低于紫杉醇.结论 维泰醇具有较强的抗肿瘤转移活性,虽然其抗转移能力弱于紫杉醇,但其低细胞毒特性依然有望成为新的抗肿瘤转移的药物.
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氨甲喋呤对映体对ECV304细胞抑制作用及其机制
目的 探讨氨甲喋呤[(±)MTX]及其对映体[(+)MTX、(-)MTX]对ECV304细胞的生长抑制作用并探讨其机制.方法 采用培养的ECV304细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜观察细胞的形态学变化;碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测细胞周期.结果 在0.1～150 μmol·L~(-1)范围内,(+)MTX、(-)MTX和(±)MTX作用于ECV304细胞24、48、72 h,均抑制细胞ECV304增殖,但抑制强度依次为(+)MTX>(±)MTX>(-)MTX,倒置显微镜观察不同浓度(±)MTX、(+)MTX和(-)MTX作用ECV304细胞不同时间后,出现细胞体积变小、核固缩等形态学改变.用10 μmol·L~(-1)的(+)MTX、(-)MTX和(±)MTX作用ECV304细胞48 h后,PI单染流式细胞术检测ECV304细胞周期的影响,表明MTX消旋体及单一体干扰ECV304细胞DNA合成.结论 (+)MTX和(-)MTX对ECV304细胞的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,(+)MTX的抗ECV304细胞增殖作用明显强于(-)MTX.
