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首页 > 文献资料

  • 099 镍致癌的分子机制

    作者:张晓宇;张敬;张军

    人群流行病学调查和动物学实验均已证实镍可以引起肺癌和鼻咽癌,1987年国际癌症研究机构(IARC)将镍及其化合物列为一类致癌物.镍致癌过程中,细胞遗传物质结构和功能遭受破坏、癌基因活化、抑癌基因失活可启动细胞癌变;细胞抗氧化系统的失衡、细胞骨架系统损伤、DNA损伤修复受抑制则促进细胞的癌变进程.镍通过促进DNA超甲基化,抑制组蛋白乙酰化,进一步使染色质浓缩,从而使基因沉默.其中,癌基因(如ras、myc)的激活、抑癌基因(如Rb、p53)的失活是镍致癌的关键.

  • JNK基因RNAi对镉致293细胞凋亡的影响

    作者:喻道军;徐兆发;王雨;王家骏

    目的 利用RNAi技术探讨JNK基因在镉致293细胞凋亡过程中的作用.方法 细胞转染siRNA-JNK后染镉,用rt-PCR、Western blotting法测JNK基因表达,流式细胞术测细胞凋亡,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测细胞活力.结果 30 μmol/L氯化镉可使293细胞JNK基因Mrna和蛋白表达明显增高,细胞凋亡增加.siRNA-JNK可抑制这些效应,而错义siRNA-JNK和单纯转染试剂无效.结论 JNK基因在镉致293细胞凋亡过程中起到关键作用.

  • 基因沉默机制与预防对策

    作者:房师松;邓平建;赵树进

    随着转基因技术在高等生物中的广泛应用,转基因沉默受到越来越多的重视.转基因沉默可发生在转录和转录后两种水平.转基因的甲基化、重复拷贝以及与内源基因的同源序列都可以引起转基因的沉默现象.引起转基因的沉默机制有多种,本文论述了目前引起转基因沉默的主要机制和几点预防对策.

  • 基因沉默原理及研究进展

    作者:张文钊

    基因沉默是生物体细胞在表达过程中因各种原因导致部分基因失去转录活性不表达或减少表达的现象.研究表明,基因沉默主要有两种途径:转录水平基因沉默及转录后基因沉默.转录水平基因沉默分子机制主要包括基因及启动子甲基化、重复序列等;转录后基因沉默分子机制包括共抑制、RNA干扰、基因压制等.基因沉默具有重要的生物学意义,其在抗肿瘤及抗病毒方面有很好的成果,在基因治疗上已掀起一场真正的革命.

  • 插入失活法构建2型猪链球菌突变株

    作者:路玲玲;李蓉;李文君;袁媛;郑玉玲;王恒樑;姜永强

    目的 构建2型猪链球菌突变株05ZYΔ0913,05ZYΔ0936.方法 以05ZY为模版,分别扩增0913、0936基因内部504bp,549bp片段为同源臂,与pSET4S质粒进行连接,将连接产物转入DH5a感受态细胞中,构建栽体0913-pSET4S,0936-pSET4S.然后利用插入失活法,将构建的0913-pSET4S、0936-pSET4S裁体通过电转化导入2型猪链球菌的感受态细胞中,利用壮观霉素抗性筛选得到阳性转化子,并用PCR进行鉴定.结果 筛选到的菌株均能抵抗100μg/ml壮观霉素,经PER鉴定,为失活了目的片(0913和0936片段)的2型猪链球茵突变株.结论 本研究成功构建了2个突变株,为进一步研究目的片段的基因功能奠定了基础.

  • TIEGsiRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响

    作者:孟晓军;舒晓春;曾映娟;文江华;胡芳;杨琼;张瑜;叶礼红;孙辽

    目的 观察TIEG基因沉默对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响.方法 以pshRNA-copGFP-lentivector作为载体,构建含有TIEG基因的慢病毒载体psiRNA-TIEG,转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E),然后给予AGEs刺激24 h和48 h,采用Western blot方法 测定PAI-1蛋白的表达水平.结果 AGEs以时间依赖方式上调NRK52E细胞TIEG mRNA和PAI-1蛋白表达.TGF-β1中和抗体可有效降低AGEs刺激NRK52E细胞48 h后PAI-1的表达水平(1.150±0.089 vs 0.707±0.015,P<0.05).TIEGsiRNA转染后可显著下调AGEs刺激NRK52E细胞48 h后TIEG mRNA表达水平(0.852±0.019vs0.448±0.028,P<0.01),及PAM蛋白表达水平(0.396±0.042vs 0.245±0.063,P<0.05).结论 TIEG基因沉默能有效抑制AGEs诱导NRK52E细胞PAI-1的表达.

  • 人参皂苷Rb1对C2 C12骨骼肌细胞葡萄糖利用及AMPK信号通路相关基因表达的影响

    作者:赵丹丹;吴瑞;白颖;莫芳芳;马如风;柳辰玥;朱如愿;左加成;姜广建;张东伟;高思华

    目的:观察人参皂苷Rb1对胰岛素抵抗(IR)的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖利用的影响,并基于AMPK信号通路探讨其可能的作用机制.方法:将C2C12细胞分为正常组、模型组、人参皂苷Rb1组,模型组以0.25 mmol/L棕榈酸,1%小牛血清白蛋白培养16 h诱导IR,人参皂苷Rb1组在模型组的基础上以1、3、10、30、100μmol/L浓度的人参皂苷Rb1分别干预24 h和48 h,通过检测培养液中的葡萄糖含量反映葡萄糖消耗量,并应用CCK8试剂盒及光镜观察不同浓度人参皂苷Rb1对C2C12细胞活性及形态的影响,实时荧光定量PCR扩增分析人参皂苷Rb1对C2C12细胞AMPKα、SIRT-1、PGC-1α基因表达的影响.并应用shRNA沉默AMPKα的表达,构建AMPKα低表达的骨骼肌细胞模型,以1、3、10、30、100μmol/L浓度的人参皂苷Rb1分别干预24 h和48 h,与不含人参皂苷Rb1的培养液比较,再次验证人参皂苷Rb1对C2C12细胞葡萄糖利用的影响及其与AMPK信号通路的关系.结果:1、3、10、30μmol/L人参皂苷Rb1对C2C12细胞形态及活性无显著影响,而100μmol/L人参皂苷Rb1造成C2C12细胞活性降低及部分细胞死亡.10,30μmol/L人参皂苷Rb1能够促进IR的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗量,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且人参皂苷Rb1能够上调C2C12细胞AMPKα、SIRT-1、PGC-1α的基因表达(P<0.05).10、30μmol/L人参皂苷Rb1亦能增加AMPKα低表达的骨骼肌细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05),而该作用程度低于其对棕榈酸诱导的C2C12细胞IR的影响,且RT-PCR结果显示人参皂苷Rb1能上调AMPKα低表达的C2C12细胞SIRT-1、PGC-1α 的基因表达.结论:人参皂苷Rb1能够有效促进IR的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗,该作用与调节AMPK信号通路有关,但除AMPK信号通路亦有其他作用途径.

  • 基因沉默技术研究丹参酮Ⅱ A抗雌激素受体阴性乳腺癌细胞增殖的GPER途径

    作者:赵丕文;臧金凤;陶仕英;陈梦;孙丽萍;牛建昭

    目的:利用经典核雌激素受体(ER)阴性、膜G蛋白偶联雌激素受体(GPER)阳性乳腺癌SKBR3细胞探索丹参酮Ⅱ A(Tanshinone Ⅱ A)对肿瘤细胞增殖活性的影响及其GPER介导功能.方法:应用GPER SiRNA转染构建GPER基因沉默的SKBR3细胞,并用Western Blot方法检测基因沉默效果;利用MTT细胞增殖速率、PI细胞周期测定方法观察丹参酮Ⅱ A对SKBR3细胞增殖速率、细胞增殖指数的影响及GPER的介导作用.利用Western Blot方法检测丹参酮Ⅱ A对SKBR3细胞周期蛋白Cyclin D表达的影响及GPER的介导功能.结果:(1×10-5~1×10-8)mol/L丹参酮Ⅱ A能够显著降低SKBR3细胞增殖速率,(1×10-5~1×10-6)mol/L丹参酮Ⅱ A能够显著下调细胞增殖指数,且上述抑制作用可因GPER基因沉默而明显减弱.Western Blot测定结果表明, (1×10-5~1×10-6) mol/L丹参酮Ⅱ A可使SKBR3细胞Cyclin D蛋白表达显著降低,且该效应可被GPER基因沉默所拮抗.结论:丹参酮Ⅱ A具有抑制乳腺癌SKBR3细胞增殖的作用,该抑制作用是经GPER途径介导的.

  • 沉默Cx43基因对左归丸调控MC3T3-E1细胞Runx2、Osterix表达的影响

    作者:桑红灵;周安方;喻小明;孙志博

    目的:研究沉默Cx43基因对左归丸含药血清调控MC3T3-E1细胞成骨相关基因Runx2、Osterix表达的影响.方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默Cx43基因,培养细胞分为正常对照(A)组、基因沉默(B)组、含药血清(C)组、中药加基因沉默(D)组.RT-PCR法检测培养第7、14、21天细胞Runx2、Osterix mRNA表达情况,进行组间对比.结果:左归丸含药血清可以促进MC3T3-E1细胞分化,显著增加分化中后期Runx2,尤其是Osterix mRN A的表达,A、C组比较,P<0.05或P<0.01.沉默Cx43基因导致细胞分化中后期Runx2、Osterix mRNA表达显著下降,A、B组比较,P<0.05;同时导致左归丸上述作用显著下降,C、D组比较,P<0.05.结论:沉默Cx43基因导致左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞Runx2、Osterix mRNA表达的作用显著下降.

  • 胃康宁对人胃黏膜上皮细胞电压依赖性阴离子通道沉默与过表达后细胞能量代谢的作用

    作者:刘燕君;佟丽;鲁思凡;刘亭亭;常玉娟;张平;刘涛;史海霞;周Aimin

    目的 从能量代谢方面探讨胃康宁治疗功能性消化不良的可能作用机制.方法 人胃黏膜上皮细胞GES-1采用3条靶向电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)的siRNA转染细胞后检测其沉默效率;转染DDK-Myc质粒、VDAC1-DDK-Myc质粒检测VDAC1的过表达效率.GES-1细胞以1×104个细胞铺96板,分为空白对照组、阳性对照组和胃康宁低、中、高剂量组,每组5个平行孔.空白对照组不加任何药物,阳性对照组细胞沉默或过表达后加多潘立酮片2.5 μmol,胃康宁低、中、高剂量组细胞沉默或过表达后分别加0.025、0.100、0.300 μg/μl.24h后利用生物发光法检测各组沉默或过表达前后细胞ATP的含量. 结果 siRNA1转染能降低VDAC1基因和蛋白水平,DDK-Myc质粒、VDAC1-DDK-Myc质粒转染能均能升高VDAC1蛋白水平,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).各组细胞沉默VDAC1后ATP含量均较本组沉默前降低(P<0.05或P<0.01).各组细胞过表达VDAC1后ATP含量较本组转染前明显升高(P<0.05);与空白对照组VDAC1-DDK-Myc转染后比较,胃康宁中剂量VDAC1-DDK-Myc转染后细胞中ATP含量明显升高(P<0.05).结论 胃康宁可能通过促进胃上皮细胞能量代谢治疗功能性消化不艮.

  • CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

    作者:郭兴启;武晓亮;侯文萃;李芳

    以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVyNCP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析[1].此次以T3代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVYNCP基因的沉默,而且CMV对PVYNCP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVyN CP基因沉默则未受到影响.采用ELISA方法对CMV+PVyN复合接种的转基因植株进行PVyN检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVyN,植株叶片对PVyN表现为抗病.而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVYN,植株叶片对PVYN表现为感病.该文报道了在表达PVYNCP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失.

  • RNA干扰抗病毒研究进展

    作者:高永珍;金奇

    RNA干扰(RNA Interfering,RNAi),又称RNA干涉,是一种由双链RNA介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制,它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机制,广泛存在于各种生物,如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物,包括人类.

  • siRNA沉默HPV18-E7基因表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响

    作者:付海丹;宋毓平;张庆华;田训;陈宏伟;李贺梅;曾真;李瑞

    研究小干扰RNA(siRNA)沉默18型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus 18,HPV18) E7基因对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响.培养人宫颈癌HeLa细胞株,构建靶向E7基因的两条siRNA,转染HeLa细胞株(实验组:分为siE7-1组和siE7-2组),以不做任何处理的HeLa细胞作为空白对照组(NC),转染无功能siRNA的HeLa细胞作为阴性对照组(Scramble,SCR).转染48 h后,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染E7 siRNA 后HeLa细胞mRNA含量变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测E7蛋白表达量变化;流式细胞术Flow cytometry (FCM)检测HeLa细胞凋亡情况;克隆形成和CCK-8检测HeLa细胞生长增殖情况.与NC组相比,siE7-1组和siE7-2组E7基因mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.01);转染48 h后,与NC组相比,siE7-1和siE7-2实验组HeLa细胞内HPV18-E7蛋白表达水平明显下降(P<0.05);转染48 h后,siE7-1组和siE7-2组的细胞凋亡率分别为17.78%和36.44%,与NC组相比明显增多,差异有统计学意义(P<0.01),细胞凋亡结果提示siRNA沉默E7促进HeLa细胞凋亡;CCK-8实验结果显示siE7-1组和siE7-2组细胞生长增殖抑制,差异有统计学意义(P<0.01);克隆形成实验结果与CCK-8实验结果一致,siE7-1组和siE7-2组HeLa细胞形成的克隆数明显少于NC组,细胞生长增殖抑制(P<0.01).研究结果表明,沉默E7基因促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制增殖,为宫颈癌治疗提供潜在靶点.

  • RNAi实验技术研究进展

    作者:石燕

    过去在对生物体基因功能研究时,通常利用反义寡核苷酸、核酶[1]等抑制目的基因表达,而近年来发现了一种新的诱导基因沉默的技术,即RNA干扰(RNA interference,RNAi).与其它关闭基因工具不同,RNAi是一种由双链RNA介导的特异性抑制同源基因表达的技术.由于它具有高特异性和高效性,已经广泛应用于植物、真菌、蠕虫和低等脊椎动物以及哺乳动物的基因功能研究,并且在人类基因组功能研究和基因药物研制及基因治疗等方面,有很好的应用前景.

  • 慢病毒介导的Nestin基因沉默抑制人食管癌ECA109细胞增殖

    作者:曹燕妮;王华川;王聪懿;朱深银;温剑虎

    目的:通过体外实验探讨沉默巢蛋白( Nestin)基因对人食管癌ECA109细胞增殖能力的影响及可能机制。方法合成Lenti-Nestin慢病毒载体,实验设blank组、scrambled组和Lent-Nestin组,转染ECA109细胞,建立稳定沉默Nestin基因的细胞系Lenti-Nestin;用qRT-PCR和Western blot检测Nestin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖能力;平板集落实验检测细胞的集落形成。结果稳定沉默Nestin的细胞系构建成功;与blank组和scrambled组相比,Lent-Nestin组中Nestin mRNA( P<0.01)和蛋白( P<0.05)水平明显降低;细胞增殖能力明显降低( P<0.01),集落形成能力显著下降( P<0.05);沉默Nestin表达后,c-myc、cyclin D1表达明显受到抑制( P<0.05)。结论沉默Nestin基因表达可抑制人食管癌ECA109细胞的增殖能力,其可能通过调控c-myc、cyclin D1表达参与其中。

  • 超声微泡介导Itch基因沉默增强T细胞对肺腺癌细胞LA795免疫杀伤作用

    作者:毛宁;熊弢

    目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,Western blot检测Itch蛋白表达.转染72 h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3% ±3.8%,Itch蛋白表达能够有效被抑制.转染72 h后,超声微泡介导沉默Itch基因显著增加T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平(P<0.05);与空白组或阴性对照组T细胞相比,在不同的靶效比水平(10 : 1、20 : 1、40 : 1),转染T细胞杀瘤活性均明显增高(P<0.05).结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Itch基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.

  • RNA干扰的体内应用研究进展

    作者:安君艳;张晓岚

    RNA干扰是由双链RNA引发的序列特异性基因沉默现象,目前已成为体外实验中抑制基因表达的首选方法 .在体内实验中,近年也已经发表了上百篇将siRNA运用于哺乳动物的研究,说明RNA干扰同样可成为体内实验的强有力工具,并有望成为一种有效的疾病治疗手段.本文就RNA干扰体内实验中的影响因素、实验设计及近年研究进展等进行综述.

  • 星形细胞上调基因-1的研究进展

    作者:张婷;杨军

    星形细胞上调基因-1(AEG-1)在多种恶性肿瘤中显著高表达,在肿瘤的发生、增殖、血管生成、抗凋亡、侵袭转移及抗药性等多方面发挥重要作用,还参与炎性反应和自然免疫过程.研究表明AEG-1与PI3 K/Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin等多种信号通路相关,同时参与RNA诱导沉默复合体介导的基因沉默.因此,AEG-1有望成为肿瘤靶向治疗的新靶点.

  • shRNA表达载体的改建及鉴定

    作者:陈娴;谢渊;赵艳;周建奖

    目的 通过改建pSilencer3.1-H1载体快速有效筛选重组shRNA表达载体,并可使线性化载体环化,长期保存.方法 制备含有单一限制性内切酶Not Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段,与BamH Ⅰ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接,构建载体pSilencer3.1-Ha/Not Ⅰ,再用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ,将含靶向目的 基因JAK2 siRNA表达框的DNA模板与其连接,构建pSilencer3.1-H1/JAK2的shRNA表达载体,提取质粒DNA,用Not Ⅰ进行单酶切,快速选择阳性克隆,选取不能被Not Ⅰ切开的质粒进行测序鉴定.随后将pSilencer3.1-H1/JAK2转染胃癌细胞系,用Western blot检测JAK2蛋白的表达.结果 通过测序证实pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ和含JAK2 siRNA表达框的表达载体成功构建,将其转染胃癌细胞系AGS后,抑制了JAK2蛋白的表达.结论 通过对 pSilencer3.1-H1表达载体的改建可以快速有效地筛选shRNA表达载体.

  • shRNAs介导的Smad2基因在小鼠成纤维细胞NIH/3T3中表达的沉默

    作者:郑嵘;熊琪;蒋思文;左波;李凤娥;徐德全;任竹青;熊远著

    目的 通过构建5个shRNA表达质粒,对转化生长因子β/Smads信号通路中受体调节性Smads蛋白中的Smad2的表达进行抑制.方法 针对鼠Smad2基因的mRNA序列,设计合成了5条shRNA-Smad2 DNA序列,分别插入至shRNA表达载体中,获得了5个shRNA-Smad2表达质粒,将shRNA表达质粒转染NIH/3T3细胞,采用半定量RT-PCR和Western blotting方法,检测shRNA表达质粒对Smad2表达的抑制效果.结果 编号为2.4的shRNA-Smad2表达质粒能够显著降低Smad2的表达,同时发现由不同的shRNA-Smad2表达质粒组成的RNAi池,产生的抑制效果比单个RNAi表达质粒的抑制效果明显提高.结论 成功地构建了特异、高效抑制Smad2表达的shRNA表达质粒.

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