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甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定
为了合成甲基对硫磷(M1605)人工抗原,用醋酸-锌粉-盐酸还原甲基对硫磷,制备氨基甲基对硫磷,重氮化法使氨基甲基对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)及中国鲎血蓝蛋白(TTH)偶合,合成人工抗原M1605-BSA、M1605-TTH.M1605-BSA免疫新西兰兔10周后,双向琼脂扩散试验和间接ELISA检测,证明得到了高价且具有较好特异性的多抗血清,成功地合成了甲基对硫磷人工抗原,为其免疫分析方法的建立提供了条件.
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禽白血病病毒p27基因在原核细胞的表达及生物学特性的初步分析
将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆入表达性载体pET28a,在大肠杆菌以His Tag融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫家兔,制备了抗ALV p27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断.检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98.6%,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性.交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异性,并且可以检测出A、B、J亚群的禽白血病病毒p27抗原.用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断.
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鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析
将鸡贫血病毒(CAV)VP1蛋白449个氨基酸中的424个氨基酸(占95%)编码序列分二段,分别克隆入表达性载体pGEX-5X-3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫小鼠4次,制备了抗CAV的多克隆抗体.通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验(IFA),结果为阳性.这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性.用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断.
关键词： 鸡贫血病毒 VP1 表达 多抗血清 间接免疫荧光试验(IFA) -
小反刍兽疫病毒M基因的截短表达及多抗血清的制备
目的 截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备.方法 之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平.因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480 bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清.结果 经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性.结论 成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础.
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弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备
目的 克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清.方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA.设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E. Coli BL21 (DE3)并以IPTG诱导表达.亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性.结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出1092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白.rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1:106多价抗血清.结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础.
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抗类鼻疽伯克霍尔德菌多抗血清的制备及评价
目的制备抗类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudoamllei,其抗原简写为BP)多抗血清,评价不同处理方式对抗原免疫原性的影响.方法 采用超声破碎、甲醛灭活、热灭活3种方式处理细菌抗原接种新西兰兔和BALB/C小鼠,检测不同抗原免疫动物抗血清的ELISA效价及凝集试验效价.结果 (1)ELISA方案佳条件:二抗稀释度为1/8 000,抗原包被浓度为4 μg/mL或8 μg/mL;凝集反应佳条件:细菌浓度为6×109 CFU/mL、凝集温度为37 ℃、观察时刻为4 h.(2)超声破碎抗原(U-BP)免疫新西兰兔和小鼠的抗血清ELISA效价高达1/64 000,高血清凝集效价分别为1/32和1/64,甲醛灭活抗原(F-BP)抗血清ELISA效价高达1/16 000,凝集效价为1/128和1/64;热灭活抗原(H-BP)抗血清ELISA效价达1/8 000,凝集效价为1/16和1/64.(3)F-BP和H-BP具有较强的免疫原性,U-BP在小鼠中的免疫原性较弱(P<0.05).结论 建立了抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多克隆抗体的检测方法,制备了高效价的抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多抗血清;甲醛灭活和热灭活细菌具有较好的免疫原性,为下一步类鼻疽伯克霍尔德杆菌的致病机制研究和疫苗研发打下了基础.
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弓形虫CDPK5基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定
目的：筛选弓形虫（Tg）CDPK5基因序列的免疫多肽，将合成多肽免疫新西兰白兔制备多抗血清，并对其功能进行鉴定。方法利用生物信息学的方法分析确定Tg CDPK5序列免疫多肽，再用合成的多肽免疫新西兰白兔制备多抗。收集多抗血清，酶联免疫吸附测定（ELISA）测定多抗滴度，蛋白免疫印迹法（Western blot）鉴定免疫活性，免疫荧光实验分析Tg CDPK5的亚细胞定位。结果通过生物信息学分析，选择Tg CDPK5序列N端一段长17 bp的多肽序列作为免疫多肽；用合成的多肽免疫兔子，成功获得多抗血清。ELISA测定多抗血清效价为1∶640000；Western blot证明该多抗血清能特异性识别 Tg CDPK5（75．4×103）条带；免疫荧光实验结果表明，该多抗能特异性识别弓形虫内源Tg CDPK5蛋白。结论研究根据 Tg CDPK5序列信息的分析，获得Tg CDPK5序列免疫多肽，并制备兔源多克隆抗体。
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甲基对氧磷人工抗原的合成及鉴定
目的 合成甲基对氧磷（M1600）人工抗原。方法 用醋酸-锌粉盐酸还原对氧磷，制备氨基甲基对氧磷，重氮化法使氨基甲基对氧磷与牛血清白蛋白（BSA）及中国鲎血蓝蛋白（TTH）偶合，合成人工抗原M1600-BSA、M1600-TTH。结果 M1600-BSA免疫新西兰兔10周后，双向琼脂扩散试验和间接ELISA检测，证明得到了高价且具有较好特异性的多抗血清。结论 成功地合成了甲基对氧磷人工抗原，为其免疫分析方法的建立提供了条件。
