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P27基因联合中药片仔癀对人骨肉瘤抑制作用观察
目的:观察P27基因重组腺病毒联合中药片仔癀对人骨肉瘤裸鼠移植瘤体内生长的抑制作用.方法:①用人骨肉瘤细胞株MG-63接种于裸鼠腋部皮下,连续传代3次,肿瘤生长稳定后,再用组织移植法构建人MG-63细胞裸鼠原位骨肉瘤模型;②肿瘤细胞接种l周肿瘤长至0.7cm左右时,选择40只肿瘤体积均一的裸鼠随机分成5组:空白对照组(8只),PBS溶液注射治疗;P27基因治疗组(8只),raav-P27病毒液注射治疗;Paav-MCS空载体组(8只),raav-MCS病毒注射治疗;片仔癀组(8只),片仔癀溶液灌胃治疗;联合治疗组(8只),raav-P27病毒液注射联合片仔癀灌胃治疗.③观测指标:骨肉瘤裸鼠成瘤率、荷瘤裸鼠生活质萤及毒副反应、肿瘤块的体积和肿瘤的生长抑制率.结果:①成功构建了裸鼠原位骨肉瘤模型;②单纯灌服片仔癀溶液、P27基因治疗及片仔癀、P27基因联合治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,与空白对照组及空载体组差异显著(P＜0.05),肿瘤生长抑制率分别达32.24%,55.25%与61.84%.空白对照组与空载体组相比,无显著差异(P＞0.05);③荷瘤裸鼠一般情况良好,活动能力较强.结论:①腺相关病毒介导的p27基因能有效抑制入骨肉瘤MC-63的生长.②P72基因与片仔癀联合应用后,产生协同作用,其抑瘤效果与改善荷瘤裸鼠的生存情况比单用片仔癀治疗或单用P27基因治疗更明显.③中药片仔癀对提高荷瘤裸鼠的生活质量有一定的帮助.
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禽白血病病毒p27基因在原核细胞的表达及生物学特性的初步分析
将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆入表达性载体pET28a,在大肠杆菌以His Tag融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫家兔,制备了抗ALV p27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断.检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98.6%,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性.交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异性,并且可以检测出A、B、J亚群的禽白血病病毒p27抗原.用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断.
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P27与胆囊癌的研究进展
P27作为一种新发现的抑癌基因,表达的P27蛋白在细胞周期调控中起重要作用.P27基因表达异常与胆囊癌发生、发展、侵袭和预后密切相关,并可作为判断预后的独立预测因子,可能在胆囊癌基因治疗中发挥重要作用.
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结直肠癌组织中p27基因甲基化与其临床病理的关系
目的 检测结直肠癌组织中p27基因启动子区CpG岛甲基化水平及其表达,并结合其临床病理参数进行分析,探讨其在结直肠癌发生发展中的作用.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应分析技术检测106例结直肠癌组织及其正常结直肠黏膜组织、22例结肠腺瘤组织中p27基因启动子甲基化,用免疫组织化学SP方法检测其蛋白表达.结果 本组结直肠癌组织中p27甲基化阳性率为59.4%(63/106),结肠腺瘤组织中为18.2%(4/22),而正常结直肠黏膜组织中为3.8%(4/106),前组与后两组之间相比差异有统计学意义(P＜0.05).低分化组结直肠癌组织中p27甲基化阳性率明显高于高中分化组(48.0%比24.7%,P＜0.05);Dukes-A+B期组与C+D期组之间相比差异有统计学意义(20.0%比41.2%,P＜0.05);有无淋巴结转移两组之间的阳性率相比差异有统计学意义(41.5%比23.1%,P＜0.05);浸润深达浆膜层的结直肠癌组织中的甲基化阳性率与未达浆膜层组相比差异无统计学意义(32.5%比24.1%,P＞0.05).结论 结直肠癌组织中存在p27基因启动子甲基化.p27基因的高甲基化与结直肠癌分化程度、浸润深度、Dukes分期及有无淋巴结转移有关.
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宫颈癌P27kip1基因突变、缺失及表达
目的探讨p27蛋白在宫颈癌中表达的意义及p27基因缺失、突变在宫颈癌发生中的作用.方法采用链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶(S-P)免疫组化法及聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法分别检测宫颈癌中p27基因的蛋白表达及其两个外显子的缺失、突变.结果 p27蛋白表达,18例正常宫颈上皮组织均为高表达,48例宫颈癌组织中,19%(9/48)高表达,81%(39/48)低表达,宫颈癌中高表达率明显低于正常宫颈组织(P<0.05);宫颈癌的分化程度中,Ⅰ级高表达50%(5/10)明显高于Ⅱ级13%(3/24)及Ⅲ级7%(1/14)(P<0.05);伴有淋巴结转移的高表达4%(1/23),不伴淋巴结转移的高表达32%(8/25),差异有显著性(P<0.05);p27基因缺失、突变分析,17例宫颈癌及8例正常宫颈组织均未发现一例外显子Ⅰa、Ⅰb及外显子Ⅱ缺失、突变.结论 p27与宫颈癌的发生发展、分化程度及淋巴结转移有关;宫颈癌中未发现p27基因缺失与突变;对p27蛋白进行检测为诊断宫颈癌及临床综合治疗提供参考.
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猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立
目的 构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测.方法 通过PCR扩增p27基因片段,与pGEX?4T?1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达.通过SDS?PAGE分析蛋白表达的形式及佳诱导时间.采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测.结果 重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的佳时间为4h.包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96％.结论 成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础.
关键词： 猴D型逆转录病毒 P27基因 原核表达 流式免疫荧光微球检测技术 -
P27基因在口腔癌组织中的表达及其意义
目的 探讨肿瘤抑制基因p27在口腔癌组织中的表达及其临床意义.方法 应用免疫组织化学方法(SP法)检测p27基因在62例口腔癌组织和20例正常口腔黏膜组织中的表达.结果 62例口腔癌组织中,p27的阳性表达率为38.7(24/62);p27的阳性表达与口腔病灶大小、临床分期、细胞分化程度、转移及预后有密切关系(P＜0.01或P＜0.05);与患者年龄无关(P＞0.05).结论 p27基因的表达与口腔癌的生长、浸润及淋巴结转移有关,其表达水平的高低可作为判断口腔癌预后的重要指标之一.
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重组天花粉蛋白体外诱导宫颈癌HeLa细胞p27基因去甲基化的研究
目的 研究重组天花粉蛋白(recombinant trichosanthin,rTCS)对宫颈癌HeLa细胞中p27基因甲基化状态和基因表达的影响.方法 应用不同质量浓度的rTCS(20、40、80μg/mL)处理体外培养的宫颈癌HeLa细胞后,MSP法检测用药前后细胞中p27基因的甲基化状态,Real-Time PCR法检测用药前后细胞中p27和DNA甲基转移酶1(DNMT1)mRNA水平的变化,Western-blotting法检测用药前后细胞中p27蛋白表达的变化.结果 HeLa细胞中p27基因为低表达,基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态.40μg/mL rTCS处理导致p27基因启动子区CpG岛去甲基化;在20、40、80μg/mL的rTCS作用48 h后,p27基因mRNA相对表达水平分别升高2.22、4.00、6.03倍,p27蛋白水平表达也逐渐增加;宫颈癌HeLa细胞中DNMT1 mRNA高表达,40μg/mL rTCS处理48 h可至DNMT1 mRNA表达水平降低78%.结论 rTCS通过抑制DNMT1.逆转p27基因启动子区CpG岛的甲基化状态,使宫颈癌HeLa细胞中p27基因表达活化.rTCS能逆转宫颈癌HeLa细胞p27基因甲基化状态,调控p27基因和DNMT1的表达.
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p27基因在豫北地区食管鳞癌发生发展过程中的表达及意义
目的:系统对比探讨p27基因在豫北地区食管鳞癌发生发展过程中的表达及临床病理意义.方法:应用免疫组织化学(S-P法)检测72例食管鳞癌标本(每例均包括正常食管黏膜、非典型增生和浸润癌)中p27基因的表达,并分析其临床病理意义.结果:p27基因在非典型增生和浸润癌的表达明显低于正常黏膜上皮(P<0.01);p27 基因表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05);与浸润深度亦显示一定的相关趋势(X2=3.80),但与组织学分级、年龄和性别无明显相关关系(P>0.05).结论:p27基因表达异常在豫北地区食管鳞癌发生发展过程具有重要意义,并与食管鳞癌的转移等恶性行为相关,可作为豫北地区食管鳞癌早期诊断和判断预后的重要分子指标.
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结直肠癌患者门静脉血p27基因甲基化检测及其临床意义
目的 研究结直肠癌患者门静脉血、外周血中p27基因甲基化状态的变化,探讨其与临床病理特征的关系.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应分析技术,检测106例结直肠癌患者的门静脉血中p27基因启动子甲基化的阳性率,并结合临床病理进行分析.结果 结直肠癌患者外周血中的p27基因甲基化阳性率为24.5%(26/106),对照组为3.4%(1/29).结直肠癌患者门静脉血中p27基因甲基化阳性率为30.2%(32/106),其中Dukes分期:A+B期和C+D期阳性率分别为20.0%(11/55)和41.2%(21/51);低分化和高中分化阳性率分别为48.0%(12/25)和24.7%(20/81);有无淋巴结转移阳性率分别为41.5%(17/41)和23.1%(15/65);浸润深度:未达浆膜层和达浆膜层阳性率分别为24.1%(7/29)和32.5%(25/77).门静脉血中p27基因甲基化与结直肠癌患者的临床分期、组织分化程度及有无淋巴结转移均有关(P＜0.05),但与患者的性别、年龄、肿瘤部位和大小均无统计学意义(P＞0.05).结论 结直肠癌的发生发展与p27基因甲基化有关.检测结直肠癌患者门静脉血中p27基因甲基化程度,可为临床分期及预后的判断提供依据.
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大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡影响及其机制探讨
目的:探讨大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法:体外培养的K562细胞,用不同浓度大蒜素处理24、48、72 h,MTT法测定其对K562细胞增殖的影响;大蒜素(浓度分别为3、6、12μg/ml)处理K562细胞48 h后,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Rh123探针染色流式细胞仪检测线粒体膜电位变化,分光光度计检测Casepase-3、Casepase-9相对活性,western blot法检测p16、p27基因表达情况.结果:大蒜素(浓度3～24μg/mL)能抑制K562细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性;大蒜素(浓度分别为3、6、12μg/mL)作用K562细胞48 h后,细胞凋亡率分别为13.5％、21.4％、34.6％,对照组凋亡率为2.2％;Casepase-3、Casepase-9相对活性显著增加;p16、p27的表达升高,呈剂量依赖性.结论:大蒜素能抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与上调p16、p27基因的表达,增加细胞Casepase-3、Casepase-9活性及降低线粒体膜电位有关.大蒜素是一种前景广阔的抗肿瘤药物.
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卵巢上皮癌中P27基因的表达及其临床意义
目的:研究P27基因在卵巢上皮性恶性肿瘤中的表达及其临床意义.方法:用免疫组织化学方法检测18例卵巢正常组织、20例卵巢良性肿瘤及38例卵巢癌组织中P27基因的表达情况,并与临床特征相比较.结果:P27蛋白在卵巢上皮性恶、良性肿瘤和正常组织中阳性表达率分别为32%、65%和78%,P27蛋白在卵巢上皮性恶性肿瘤中的表达明显低于卵巢正常组织和卵巢良性肿瘤.在细胞分化程度Ⅰ级的肿瘤中,P27蛋白表达阳性率明显高于分化程度Ⅱ级和Ⅲ级的肿瘤(P<0.01);在临床分期早期的肿瘤中,P27蛋白的表达率明显高于临床分期晚期的肿瘤(P<0.01).不伴淋巴转移的P27蛋白的表达率明显高于有淋巴转移的蛋白的表达率(P<0.01).结论:P27基因的表达与卵巢上皮性恶性肿瘤的细胞分化程度、临床分期及有无淋巴转移密切相关.临床检测卵巢上皮性肿瘤P27蛋白的表达,可以作为判断卵巢上皮性恶性肿瘤生物学行为及患者预后的参考指标.
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Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及SP1和p27蛋白表达的影响
目的 研究Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及p27和SP1蛋白表达的影响.方法 构建Skp2基因干扰慢病毒质粒,包装后感染HepG2细胞.48 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；侵袭小室试验检测细胞侵袭能力；Western blot检测Skp2基因下调后p27和SP1蛋白的表达情况.结果 与正常HepG2细胞组相比,Skp2干扰慢病毒组细胞Skp2蛋白的表达明显下调,p27蛋白表达大幅增加,细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加近两倍,G0/G1期细胞增多；SP1蛋白表达减少,浸润、迁移的细胞数减少约50％(P＜0.05).结论 Skp2蛋白表达下调抑制了HepG2细胞的增殖,促进HepG2细胞的凋亡,造成细胞侵袭能力减弱.Skp2蛋白表达下调导致p27蛋白表达上调、SP1蛋白表达下调,在上述生物学特性变化中可能发挥了重要作用,为深入探讨肝癌的病理机制奠定了基础.
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p27kip1基因诱导食管癌细胞凋亡实验研究
目的探讨p27基因诱导人食管癌细胞凋亡的作用.方法构建重组体腺病毒Ad-p27kipl,转移到培养的人食管癌细胞EC-9706,用流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法观察Ad-p27kip1诱导EC-9706细胞凋亡的作用.结果成功构建重组体腺病毒Ad-p27kip1,病毒滴度为1.24×1012 CFU/ml,在感染倍数≥50感染强度时,即可达到100%的转导效率.Ad-p27kip1转染食管癌细胞后,流式细胞术检测在G1期前出现亚倍体凋亡峰.细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯度.TUNEL法检测凋亡指数分别为37.3±3.4(Ad-p27kip1组)及1.3±0.2(空白对照组),差异有显著性(P＜0.01).结论p27可有效诱导食管癌细胞凋亡,这一发现将在探索食管癌的基因治疗方面具有重要意义.
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shRNA干扰对肺癌细胞内Skp2和p27水平及其生长的影响
目的:探讨干扰肺腺癌SPC-A-1细胞中Skp2 (S-phase kinase associated protein, Skp 2)基因的发夹结构RNA (small hairpin RNA, shRNA)对肺癌细胞Skp2和p27基因表达的影响及对细胞生长的影响.方法:设计、合成特异性的shRNA序列并与pGenesil-1质粒载体连接转染SPC-A-1细胞,经过稳定筛选后的肺癌细胞,通过RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞内Skp2、p27mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线.结果:在转染干扰RNA后SPC-A-1细胞内的Skp2mRNA及蛋白表达下降明显,而p27蛋白水平却明显上升,这与抑制了Skp2表达导致p27降解减少有关.生长曲线表明细胞生长受到了抑制.结论:成功构建了针对Skp2基因的shRNA真核表达载体,能有效抑制肺癌细胞生长,并使得skp2基因表达下降,p27基因的表达增多,为肺癌细胞的基因治疗提供了实验依据.
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猴D型逆转录病毒p27基因的克隆表达及诊断价值评价
目的 克隆表达猴D型逆转录病毒(SRV) p27基因,评价其诊断价值.方法 PCR扩增p27基因片段,定向克隆至原核表达载体pET-28b(+),重组质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,目的蛋白经镍柱亲和层析纯化后用ELISA方法评价其诊断价值.结果 重组质粒转化宿主菌后在37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓-度为0.5 mmol/L的条件下诱导4h,可溶性p27蛋白表达量大,且具有免疫学活性.纯化后测定融合蛋白浓度为2.043 g/L,纯度93.3％,以融合蛋白为诊断抗原包被ELISA板检测3份标准阳性血清和22份阴性血清,检出率为100％.结论 p27基因成功表达并具有良好的反应原性,可作为猴D型逆转录病毒血清学检测的候选抗原.
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肿瘤相关基因在头颈肿瘤中的表达研究进展
近年来,随着分子生物学的飞速发展,人们逐渐认识到细胞癌变是一个多因素、多阶段的过程,在癌变的不同阶段,都有不同的基因发生改变,因而通过研究每个阶段的基因改变并检测这些基因标志物,就可以准确了解病变进展,发现早期病变并判断患者预后.而肿瘤中基因表达的研究是了解肿瘤与基因相互关系的基础.目前已知与头颈肿瘤发病的相关基因包括p53、p16、p21、p27、RB、FHIT、CD44、PCNA、c-myc、erb-B、cyclin D1、ras、nm-23、E-cadherin及Fibronectin等.文章就p16、p27、p53、增殖细胞核抗原、E型钙依赖性黏附蛋白及纤维连接蛋白等在头颈部肿瘤中表达研究作一简要综述.
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曲格列酮抑制甲状腺乳头状癌细胞生长的体外试验
目的:研究曲格列酮对甲状腺癌细胞IHH-4生长的影响及其作用机制.方法:将甲状腺癌细胞IHH-4与不同浓度的曲格列酮共培养,4-甲基偶氮四唑蓝(MTT)法观察其对甲状腺癌细胞增殖的影响,流式细胞仪DNA定量法分析曲格列酮对甲状腺癌细胞细胞周期的影响,半定量RT-PCR法测定曲格列酮对甲状腺癌细胞p27 mRNA表达的影响.结果:曲格列酮可以抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性(P＜0.05);曲格列酮作用后,甲状腺癌细胞IHH-4的G0/G1细胞的比例增加(P＜0.05);p27 mRNA的表达显著升高(P＜0.05).结论:曲格列酮可以抑制甲状腺癌细胞从G1期向S期的转化,从而抑制其增殖,曲格列酮可能成为治疗难治性甲状腺癌的一种选择.
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p27基因在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义
目的探讨喉鳞癌p27基因表达水平及其临床意义.方法用原位杂交方法检测49例喉鳞癌、19例声带息肉、12例癌旁增生组织及8例非典型增生组织中p27的表达.结果喉鳞癌组织p27阳性表达率12.24%(6/49),声带息肉63.16%(12/19),癌旁增生组织33.33%(4/12),非典型增生组织25.00%(2/8),喉鳞癌组织p27mRNA表达显著低于其他各组(P＜0.05),与临床分期有显著相关性(P＜0.05).结论喉鳞癌组织中存在p27基因的低表达,与喉癌临床分期显著相关.
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MAD2和p27在大肠癌组织中的表达及意义
目的 探讨MAD2和p27表达与大肠癌发生、发展的关系.方法 采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法,检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序.同时应用免疫组织化学方法检测大肠癌和正常组织中p27表达情况.结果 大肠癌组织中MAD2阳性表达率明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织(66.7% vs 39.6%vs 22.9%),三者间比较差异均有统计学意义(P＜0.01). MAD2表达与大肠癌肿瘤分化和患者无瘤生存时间有关(P＜0.05).大肠癌组织中未见MAD2基因突变.正常大肠黏膜组织中p27阳性表达率为81.3%,大肠癌中其阳性表达率为41.7%,两者比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MAD2和p27基因表达与大肠癌的发生及发展有关.MAD2可能是大肠癌预后的1个重要指标.
