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猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立
目的 构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测.方法 通过PCR扩增p27基因片段,与pGEX?4T?1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达.通过SDS?PAGE分析蛋白表达的形式及佳诱导时间.采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测.结果 重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的佳时间为4h.包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96％.结论 成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础.
关键词： 猴D型逆转录病毒 P27基因 原核表达 流式免疫荧光微球检测技术 -
猴D型逆转录病毒p27基因的克隆表达及诊断价值评价
目的 克隆表达猴D型逆转录病毒(SRV) p27基因,评价其诊断价值.方法 PCR扩增p27基因片段,定向克隆至原核表达载体pET-28b(+),重组质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,目的蛋白经镍柱亲和层析纯化后用ELISA方法评价其诊断价值.结果 重组质粒转化宿主菌后在37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓-度为0.5 mmol/L的条件下诱导4h,可溶性p27蛋白表达量大,且具有免疫学活性.纯化后测定融合蛋白浓度为2.043 g/L,纯度93.3％,以融合蛋白为诊断抗原包被ELISA板检测3份标准阳性血清和22份阴性血清,检出率为100％.结论 p27基因成功表达并具有良好的反应原性,可作为猴D型逆转录病毒血清学检测的候选抗原.
