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猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究
利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3.1(+)分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的pCIneo VP1和含有VP2基因的pCIneo VP2与pcDNA VP2三种真核表达质粒.将上述三种真核表达质粒分别转染IBRS-2细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表明上述三种质粒均能在IBRS-2细胞表达,表达产物位于细胞中.在此基础上,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式,间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneo VP1质粒诱导的体液免疫强,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当,pCIneo VP2诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组,pCIneo VP1和pCIneo VP2联合免疫并没有加强作用.
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汉滩病毒S基因免疫小鼠的细胞免疫应答的初步观察
将汉滩病毒S片段编码区基因插入到含CMV启动子/增强子(promoter/enhancer)的真核表达载体pVR1012中,构建成真核表达质粒pVRS22.质粒DNA经纯化后,注射经布比卡因预处理的Balb/c小鼠的股四头肌,多次免疫后,免疫小鼠淋巴细胞增殖功能的检测结果显示:免疫鼠的脾细胞能够对体外抗原刺激产生增殖反应;CTL活性检测结果表明:靶细胞51Cr的释放是效应细胞依赖性的,并且与病毒感染组的淋巴细胞的细胞毒活性相似.结果显示,用重组质粒pVRS22免疫小鼠,能够诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞活性(CTL).
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蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究
目的 研究表达产物的不同亚细胞定位对基因免疫诱导的体液免疫应答水平的影响,为基因疫苗的设计提供参考.方法 利用分子克隆技术,分别构建能表达不同细胞定位的EGFP-HPV16L1 融合蛋白和截短型 EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS 真核表达载体;通过转染 CHO 细胞,并在倒置荧光显微镜下观察表达产物的细胞定位;用重组pcDNA 载体免疫 BALB/c 小鼠;EGFP 作为抗原,ELISA法检测血清抗体吸光度.结果 ①重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1 转染的CHO 细胞核内可见到绿色荧光,pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表达载体转染的 CHO 细胞质内可见到绿色荧光;②两种不同的重组 pcDNA 载体均可诱导 BALB/c 小鼠体液免疫反应,但重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表达载体免疫组小鼠 IgG 抗体 A450 值显著高于重组pcDNAEGFP-HPV16L1 真核表达载体免疫组小鼠 IgG 抗体 A450值(P < 0.001).结论 表达产物的不同细胞定位可影响基因免疫诱发的体液免疫应答水平,定位于细胞质内的蛋白分子较定位于细胞核的蛋白分子能诱导机体更强的体液免疫反应,这为以增强体液免疫反应为目的 的基因疫苗的设计提供了参考.
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新型双启动子表达质粒pCMVnir的构建及其促进基因免疫效果的研究
目的构建一种新型双启动子表达载体pCMVnir,研究其与胞内寄生菌联合应用促进基因免疫效果的作用. 方法细菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB为厌氧诱导启动子,根据nirB启动子的结构,设计合成改良的nirB,置换三启动子载体pTriEx-4中的T7Lac和P10启动子,而保留其CMVie启动子,获得携带CMVie和nirB双种启动子的新型载体pCMVnir,或称为pCN.构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒,分别转化S. SL3261、E.coli DH5α和CHO等细胞,检测报告基因的表达情况以确定两种启动子的活性.pCN-EGFP转化S. SL3261,接种BALB/c小鼠,定期解剖小鼠收集黏膜相关淋巴组织,观察重组细菌和载体DNA在细胞中的定植及稳定性.免疫接种小鼠,并定期收集小鼠血清和阴道分泌物,以重组rEGFP为抗原,用ELISA方法研究其增强免疫应答的能力.并构建人乳头瘤病毒L1E7双启动子pCN-16L1E7及对照单启动子载体pCMV-16L1E7和pNir-16L1E7,对比三者诱导黏膜免疫的差别. 结果双启动子表达载体pCMVnir可在细菌和真核细胞中有效表达报告基因,在细菌中可形成肉眼可见的荧光菌落和沉淀,转染CHO等真核细胞能够表达荧光蛋白,表明pCMVnir载体的两种启动子都有活性,其中nirB活性是受兼性厌氧调控的.pCMVnir与细菌有较好的相容性,重组细菌可在动物体内有限复制和定植达6周,质粒可在细菌中稳定存在.以rEGFP为抗原检测发现pCN-EGFP诱导的免疫反应高于常用的单启动子载体pCMV-EGFP.人乳头瘤病毒双启动子载体pCN-16L1E7诱导的免疫反应也高于其他单启动子载体. 结论双启动子表达载体pCMVnir与减毒胞内寄生菌匹配应用,能够提高抗原表达量及增强基因免疫反应的强度.并可作为一般基因克隆和表达载体,特别是作为原核表达载体,不用添加诱导物,即可获得大量表达.
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C3d-P28增强乙型肝炎病毒特异性基因免疫效果的研究
目的观察补体C3d-P28对基因免疫的调节作用及其不同拷贝数对调节作用的影响,为增强基因免疫效果寻求新方法. 方法 PCR法获得补体C3d-P28编码基因并以头尾串连方式将1～4拷贝C3d-P28编码基因克隆至pVAON33,构建pVAON33-P28.[1～4]重组质粒,然后将HBV-preS2/S编码基因分别插入pVAON33和pVAON33-P28.[1～4]质粒获得pVAON33-S2/S和pVAON33-S2/S-P28.[1～4]重组质粒.肌肉注射各重组质粒DNA(每只100μg/100μl)初次免疫小鼠,并以pVAON33为对照;12周后皮下注射HBsAg蛋白加强免疫各组小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗-HBs-IgG. 结果 pVAON33-S2/S重组质粒免疫小鼠可诱导产生特异性抗-HBs-IgG,含不同拷贝C3d-P28编码基因的重组质粒可诱导更高的特异性抗体,其中pVAON33-S2/S-P28.4重组质粒诱导的抗体水平高(P＜0.01).蛋白加强免疫后,含C3d-P28编码基因重组质粒免疫组抗-HBs-IgG迅速上升,并明显高于pVAON33-S2/S重组质粒免疫组(P＜0.05),pVAON33-S2/S-P28.4重组质粒诱导的抗体仍维持高水平. 结论不同拷贝的C3d-P28能不同程度地增强HBV-preS2/S基因免疫诱导的特异性体液免疫及其蛋白加强后的回忆反应,其中4拷贝C3d-P28的增强作用较为显著.
关键词： 基因免疫 免疫调节 补体C3d 乙型肝炎病毒表面抗原 -
含CpG基序的大肠杆菌DNA对柯萨奇病毒基因免疫的增强作用
柯萨奇病毒B组(CVB)有6个血清型,即CVB1～6.由于CVB血清型多,采用传统疫苗预防本病难度较大.为此我们构建了CVB1/B3型VP1基因重组质粒pCR3-uniB1B3,将该重组质粒转染后进行RT-PCR及免疫荧光检测,证明该表达系统可以在细胞内获得瞬时表达,并应用该质粒免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠体内产生了相应的抗体,但是其抗体水平并不令人满意.为了获得更好的免疫效果,本研究探讨了大肠杆菌CpG DNA作为免疫佐剂以期增强pCR3-uniB1B3的免疫效果.
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赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫
目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.
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淋病奈瑟菌NspA基因疫苗诱导小鼠特异性体液免疫应答
1999年Martin等首先克隆了淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因,发现其在细胞表面持续表达,菌株之间NspA氨基酸序列的同源性高达98%,提示NspA可能是研制淋病疫苗的理想抗原.我室已成功构建NspA真核表达载体pcNspA,本文研究了pcNspA基因免疫在小鼠体内诱生特异性抗体的作用.
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GM-CSF对抗原化抗体基因免疫TH细胞应答的调节作用
目的研究GM-CSF(粒-单核巨噬细胞集落刺激因子)与抗原化抗体联合基因免疫时,GM-CSF对TH细胞应答的调节作用. 方法在编码免疫球蛋白重链的质粒中分别克隆黏蛋白1(MUC1)中特异性PDTRP抗原表位和GM-CSF编码基因,构建含PDTRP和GM-CSF编码基因的抗原化抗体表达重组体.经脾免疫和肌肉加强的方式免疫BALB/c小鼠.采用ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体的水平及其亚类并动态观察;RT-PCR方法检测TH细胞分化中细胞因子和转录因子的表达水平. 结果抗原化抗体基因免疫能诱导机体产生免疫应答.GM-CSF增强抗原化抗体基因免疫诱生的抗PDTRP特异性IgG抗体水平并且伴随IgG1/IgG2a显著性升高,同时可增强淋巴细胞TH2型细胞因子及转录因子(IL-4、GATA-3) mRNA的表达水平. 结论 GM-CSF在增强抗原化抗体基因免疫诱导的免疫应答的同时使得免疫应答向TH2方向偏移.
关键词： 粒-单核巨噬细胞集落刺激因子 T辅助细胞 抗原化抗体 基因免疫 黏蛋白1 -
地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应
为了检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应.我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组pcDNA-L1,转染Cos-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.
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汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初步研究
目的 研究汉滩病毒S片段编码区基因免疫小鼠的作用.方法 利用基因重组技术,构建含汉滩病毒S片段编码区基因的真核表达质粒.用此质粒直接注射到BALB/c小鼠骨骼肌内进行DNA免疫,用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体.结果 在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体.加强免疫后,抗体水平显著上升,免疫荧光抗体(IFAT)滴度高达1:640.约87%的免疫动物发生了血清抗体阳转.抗体水平及小鼠血清抗体阳转率与注射的质粒DNA剂量及注射次数有关.结论 应用基因免疫技术能够诱导机体产生针对汉滩病毒的特异性免疫应答.
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基因免疫法在制备凝血酶调节蛋白抗体中的应用研究
目的探讨应用基因免疫法制备凝血酶调节蛋白 (throbomodulin, TM) 抗体.方法运用基因免疫法,即PCR特异性扩增TM胞外编码区所有碱基片段(包括信号肽,TMLEO),构建pcDNA3.1/TMLEO真核表达质粒.以碱裂解法提取,PEG沉淀法纯化质粒.将纯化后的质粒pcDNA3.1/TMLEO经生理盐水稀释后直接肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测质粒pcDNA3.1/TMLEO在小鼠体内有无表达以及TM抗体的效价和特异性.结果通过RT-PCR以及TM含量测定在RNA以及蛋白水平上均说明质粒pcDNA3.1/TMLEO在小鼠体内有表达.以EVC-304包板的cell-ELISA检测抗体滴度, 随着免疫次数的增加,小鼠血清抗体滴度明显增加,到第五次达到高1∶ 8 000,第6～7次均保持在这一水平.小鼠抗血清通过免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学鉴定,特异性好.结论在天然TM提取纯化困难的情况下,通过基因免疫制备抗体是可行的.
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胰腺癌等肿瘤的免疫治疗
胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,早期诊断率和手术切除率均较低,预后差,因此,开展胰腺癌基因免疫治疗研究具有特殊意义,特别是多基因转染胰腺癌形成的特异性胰腺癌瘤苗对胰腺癌的治疗,免疫基因治疗主要是有效地增强机体自身的抗肿瘤作用、清除术后残留肿瘤细胞、修复肿瘤突变基因.目前肿瘤基因治疗常用的策略有:细胞因子导入,肿瘤疫苗制备,自杀基因治疗,利用反义寡核苷酸技术封闭活化癌基因以及向靶组织转移抑癌基因等.现就wtP53、GM-CSF、B7-1对胰腺癌和相关肿瘤的基因免疫治疗作用进行综述.
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不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响
目的探讨不同DNA载体及靶基因对DNA疫苗免疫效果的影响.方法用已构建的不同载体HBV S基因疫苗(pCR3.1-S,pcDNA3-S)和HBVC基因疫苗(pCR3.1-C)分别给Balb/c小鼠多点肌肉注射,2 wk后追加免疫一次,用ELISA法及MTT法分别检测小鼠血清抗-HBs及抗HBc及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应.结果免疫接种2 wk后小鼠血清抗-HBs及抗HBc抗体均明显高于对照组,载体pCR3.1的表达效力稍高于pcDNA3,但同一基因不同载体间无显著差异.不同靶基因血清抗体滴度及脾细胞对HBsAg或HBcAg的刺激指数均明显高于对照组,刺激指数pCR3.1-C组明显高于单纯pCR3.1-S注射组.结论两种载体均可以诱导较强的体液免疫应答;但同一基因不同载体间无显著差异.HBV S和C基因疫苗均可诱导较强的体液和细胞免疫应答强度;C基因以细胞免疫增高为主.
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MUC1基因免疫抑制H22肝癌生长的实验研究
目的:观察MUC1基因免疫对H22肝癌生长的特异性抑制作用.方法:采用股四头肌肌肉注射法将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫Balb/c小鼠,每次100μg,3wk/次,共3次.后一次基因免疫后3 wk,接种表达MUC1的H22肝癌细胞.2 wk后观察、记录肿瘤的生长情况.于肿瘤细胞接种后43d,处死全部动物,称肿瘤的质量.荷瘤小鼠的瘤组织常规HE染色.结果:肿瘤细胞接种后43d,MUC1预防组,质粒pcDNA3.1对照组及生理盐水阴性对照组H22肝癌大小分别为547±59 mm3,1185±84mm3和1220±95 mm3(P＜0.01);平均瘤质量分别为1.87±0.96 g,4.19±1.34 g和4.23±1.32 g(P<0.01);pcDNA3.1对照组和生理盐水阴性对照组100%可见瘤体形成,肿瘤生长,而MUC1基因疫苗预防组仅见50%(5/10)的小鼠有瘤体形成,与对照组相比,MUC1预防组H22肝癌生长受到明显抑制(P<0.01);MUCI预防组小鼠免疫保护有显著差异(P<0.05).病理学检查结果显示,与pcDNA3.1对照组相比,MUC1 DNA疫苗预防组鼠H22肝癌组织大量坏死.结论:MUC1基因免疫显著抑制H22肝癌生长.
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hsp70/CD80嵌合DNA真核表达质粒的构建及鉴定
我们将结核分支杆菌hsp70和人CD80的编码基因进行连接重组,构建成hsp70/CD80嵌合DNA真核表达质粒,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病hsp70/CD80嵌合DNA疫苗奠定了基础, 可望通过基因免疫获得免疫原性强、以低剂量即可有效刺激机体产生T细胞和B细胞应答、安全可靠的新型结核病疫苗.
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异位hCGβ基因免疫诱导的特异性抗肿瘤免疫应答
目的观察异位hCGβ基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径. 方法构建含hCGβ编码基因的质粒TR421-hCGβ,对BALB/c小鼠实施基因免疫,并以空质粒为对照.采用ELISA法和3H-TdR掺入法分别检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ-IgG抗体及其对肿瘤细胞体外生长的抑制作用;特异抗原体外刺激免疫小鼠脾细胞后,用3H-TdR掺入法和3H-TdR释放法分别检测其特异性增殖活性和细胞毒活性;皮下接种SP2/0-hCGβ细胞攻击免疫小鼠,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果. 结果全部TR421-hCGβ质粒免疫小鼠均产生高水平的抗hCGβ-IgG抗体,该抗体可抑制肿瘤细胞的体外生长,与对照血清相比,差异有显著差性(P<0.05);hCGβ蛋白、灭活SP2/0-hCGβ细胞以及两者混合均能刺激TR421-hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞的体外增殖(SI值分别为1.53、1.81和2.05),与空质粒免疫小鼠相比,差异有显著性(P<0.01);特异抗原刺激的TR421-hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞对SP2/0-hCGβ细胞的细胞毒活性明显高于SP2/0细胞(P<0.01);空质粒免疫小鼠接种SP2/0-hCGβ细胞后成瘤率为100%,瘤重达3.37 g,而TR421-hCGβ质粒免疫小鼠的成瘤率为16.66%,瘤重为0.37 g,两组比较,差异有显著性(P<0.01).结论异位hCGβ基因免疫诱导的特异性免疫应答具有抗肿瘤作用,为肿瘤的基因免疫生物治疗提供新的途径.
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人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用
目的克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA,并构建其真核表达载体,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性.方法从KG-1a细胞提取总RNA,RT-PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定,构建其真核表达载体pcDNA3.1-CD34.选取4～6周龄的BALB/c小鼠12只,随机分为3组,预先在股四头肌注射25%的蔗糖溶液50μl,然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3.1以及PBS稀释的pcDNA3.1-CD34,每2周1次共3次.免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况.结果所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长886bp,扩增片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道完全一致,并且在5′端引入HindⅢ酶切位点,3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA.随后将其定向插入真核表达载体pCDNA3.1中,称之为pcDNA3.1-CD34,经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实pcDNA3.1-CD34真核表达载体构建成功.FACS检测结果表明,用pcDNA3.1-CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅1/4只在免疫结束后的第2～6周有较低滴度的CD34抗体产生,其余3只血清中均未检测到CD34抗体.结论成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-CD34,初步证明用其进行基因免疫制备CD34单克隆抗体是可行性的.
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小鼠抗人Nanog多克隆抗体的制备及其鉴定
目的用基因免疫方法制备小鼠抗人Nanog多克隆抗体并进行鉴定.方法应用Accelrys软件分析Nanog抗原表位,选择其中免疫原性较强的抗原表位(A16～V101),从Nanog cDNA全长质粒中扩增其cDNA(258bp)序列,克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-Flt3L同时免疫小鼠,12周后用ELISA方法检测血清抗体滴度,Western blot方法鉴定抗体对人肾组织的特异性.同时将Nanog-AAV2病毒转染到HKC细胞,免疫荧光定位Nanog在细胞的表达.结果成功构建了Nanog基因免疫载体,经酶切及序列分析鉴定完全正确.ELISA结果显示抗体滴度为1∶32 000.Western blot结果显示小鼠抗Nanog多克隆抗体识别人肾组织34 kD的Nanog蛋白.免疫荧光结果表明转染的Nanog基因主要表达在HKC细胞细胞核.结论用基因免疫的方法可以成功制备高效价和高特异性抗Nanog多克隆抗体.
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HCV HVR1相关基因诱导小鼠免疫反应的比较
目的 对小鼠进行两种基因免疫方法的比较:分别以真核质粒pcDN3.1(+)为载体和以伤寒减毒活菌苗为载体,携带丙肝病毒高变区1(HVRI)相关模拟表位的DNA序列,诱导细胞免疫应答,以寻找较好的疫苗免疫途径.方法 根据HCV HVR1模拟表位的肽序列合成DNA序列,并将其连接到pcDN3.1(+)(pcDN3.1-SP)真核质粒上,然后用重组质粒转化伤寒减毒活菌苗Ty21a(Ty21a-SP).Ty21a-SP和peDN3.1-SP分别经口服和肌注免疫小鼠后,杀鼠、分离脾细胞,脾细胞经混合肽刺激后,用流式细胞仪检测CD8+IFN-γ+细胞;用非放射性MTS法检测细胞增殖反应;以非放射性LDH法检测CTL反应.结果 对小鼠用pcDN3.1-SP和Tyr21a-SP免疫后,取脾淋巴细胞经混合肽刺激后,明显增殖,CD8+IFN-γ+淋巴细胞比例增高,并诱导较强的CTL反应,但pcDN3.1-SP免疫后的上述反应较Ty21a-SP免疫弱.结论 使用伤寒减毒活菌苗作为载体进行基因免疫有利于产生细胞免疫反应.
