首页 > 文献资料
-
登革病毒衣壳蛋白研究进展
登革病毒衣壳蛋白是病毒的结构蛋白之一,可与病毒基因组RNA结合构成病毒的核衣壳.同时,衣壳蛋白可进入细胞核,与多种蛋白质结合,并有可能参与对宿主细胞的调控,在病毒的感染过程中具有重要的作用.本文综述了近年来登革病毒衣壳蛋白的结构与功能等方面的研究进展情况.
-
原型泡沫病毒Bel1蛋白核定位信号精细定位及相互作用核输入蛋白初探
Bel1是原型泡沫病毒(Prototype foamy virus,PFV)的反式激活因子,在病毒的复制周期中发挥关键作用.研究表明,Bel1含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),但其精确氨基酸组成尚不明确,介导其入核的核输入蛋白亦未见报道.本研究利用插入Bel1截短片段的EGFP-GST融合表达体系,通过绿色荧光观察其亚细胞定位,首次精确确定Bel1 NLS序列为215 PRQKRPR221;定点突变明确了K218、R219和R221为Bel1核定位的必需残基,证明Bel1 NLS属单分型核定位信号;GST-Pulldown实验显示这段序列可与α核输入蛋白(Importin α/Karyopherin alpha,official symbol:KPNA) KPNA1、KPNA6和KPNA7相互作用,即Bel1可能藉此转运入核.
-
伪狂犬病毒UL49基因核定位信号的初步确定
伪狂犬病毒UL49基因编码的蛋白VP22是一种皮层蛋白,其生物学功能尚不清楚.预测并确定PRV UL49的核定位信号,可为研究其编码蛋白VP22的蛋白转导功能及作用机理奠定基础.通过生物信息学软件分析预测到,PRV UL49基因存在潜在的两个核定位信号:5～21位氨基酸序列(RKTRVA ADETASGARRR) NLS1和241～247位氨基酸序列(PGRKGKV) NLS2.本文将实验分为对照组、NLS1和NLS2同时缺失组、NLS1缺失组和NLS2缺失组四组,并通过PCR扩增、分子克隆等技术获得PRV Ea株UL49基因.以pEYFP-N1为载体,将UL49基因及各组缺失或突变片段插入EYFP上游,成功构建PRV pUL49-EYFP重组质粒及一系列缺失突变体,转染COS-7细胞后观察荧光定位.实验结果表明,确认预测到的NLS1和NLS2具有核输入功能,且位于241-247位的氨基酸序列(PGRKGKV)的入核功能更强,5～21位氨基酸序列(RKTRVA ADETASGARRR)为双向核定位信号,其同时具有核输出的功能.
-
蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究
目的 研究表达产物的不同亚细胞定位对基因免疫诱导的体液免疫应答水平的影响,为基因疫苗的设计提供参考.方法 利用分子克隆技术,分别构建能表达不同细胞定位的EGFP-HPV16L1 融合蛋白和截短型 EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS 真核表达载体;通过转染 CHO 细胞,并在倒置荧光显微镜下观察表达产物的细胞定位;用重组pcDNA 载体免疫 BALB/c 小鼠;EGFP 作为抗原,ELISA法检测血清抗体吸光度.结果 ①重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1 转染的CHO 细胞核内可见到绿色荧光,pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表达载体转染的 CHO 细胞质内可见到绿色荧光;②两种不同的重组 pcDNA 载体均可诱导 BALB/c 小鼠体液免疫反应,但重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表达载体免疫组小鼠 IgG 抗体 A450 值显著高于重组pcDNAEGFP-HPV16L1 真核表达载体免疫组小鼠 IgG 抗体 A450值(P < 0.001).结论 表达产物的不同细胞定位可影响基因免疫诱发的体液免疫应答水平,定位于细胞质内的蛋白分子较定位于细胞核的蛋白分子能诱导机体更强的体液免疫反应,这为以增强体液免疫反应为目的 的基因疫苗的设计提供了参考.
-
核定位信号在JC病毒样颗粒入核转运中的作用
目的 探讨JC病毒(JCV)主要外壳蛋白VP1所含核定位信号(NLS)在JCV病毒样颗粒(VLP)入核转运中的作用.方法 应用位点诱变法将JCV野生型VP1(wtVP1)氨基末端3个氨基酸:第5位赖氨酸、第6位精氨酸、第7位赖氨酸分别置换为丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸,制备成NLS变异的VP1(△NLS-VP1).编码△NIS-VP1的基因克隆到原核表达质粒pET-15b中,体外表达、重组VP1 NLS变异的病毒样颗粒(△NLS-VLP),异硫氰基荧光素(FITC)标记后感染地高辛渗透或未渗透的SVG细胞,荧光显微镜观察VLP入核转运.结果 wtVP1组成的病毒样颗粒(wtVLP)可以进入地高辛渗透或未渗透的SVG细胞核,而△NLS-VLP只能进入细胞浆,不能进入细胞核;体外转染后,wtVP1主要在SVG细胞核表达,而△NLS-VP1主要在细胞浆表达;包裹外源性DNA的VLP感染SVG细胞后,则wtVLP包裹的DNA在细胞浆和细胞核内均可检测到,而△NLS-VLP包裹的DNA只能在细胞浆检测到,不能在细胞核内检测到.VLP体外结合分析发现,wtVLP与胞浆转运因子(importin)α、β均可结合,而△NLS-VLP与importin α、β均不能结合.结论 VP1 NLS对于VLP入核转运是必需的,VLP的入核转运是由VP1 NLS与importin相互作用介导的.
-
NFκB核定位基序增强超声微泡介导的外源基因转染效率
目的 评价NFκB核定位基序增强超声靶向微泡破坏(UTMD)介导的外源基因转染效率的价值.方法 构建人基质细胞衍生因子1α(phSDF-1α)质粒(phSDF-1α组),并插入NFκB核定位基序,构建具有核输入功能的目的基因质粒phSDF-1α-NFκB(phSDF-1α-NFκB).用Cy3核酸染料标记两种质粒后在优化的UTMD条件下分别转染人脐静脉血管内皮细胞.CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪和荧光显微镜分别检测质粒的入胞效率和入核效率,RT-PCR和ELISA检测SDF-1α基因和蛋白表达水平.比较两种质粒的入核效率和目的基因表达率.结果 在优化的UTMD条件下phS-DF-1α组和phSDF-1 α-NFκB组细胞存活率和质粒入胞效率差异均无统计学意义(P均＞0.05),两组质粒入核率分别为(12.96±4.46)％和(83.25±12.15)％,SDF-1α基因相对表达量分别为(39.25±10.14)％和(118.25士27.57)％,SDF-1α蛋白表达量分别为(14.11±5.74)ng/mg和(65.35±11.12)ng/mg蛋白,后者均显著高于前者.结论 NFκB核定位基序能显著增强质粒入核,提高UTMD介导的外源基因转染效率.
-
钙调磷酸酶B同源蛋白2核定位对宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响
目的 研究钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)在细胞核内定位对人宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响.方法 将CHP2核输出信号序列(NES)突变,转染HeLa细胞,从而使CHP2定位在细胞核内,采用MTT法检测HeLa细胞的细胞活力的改变;利用软琼脂集落形成实验观察HeLa细胞集落形成大小和数量的变化;通过体内实验观察HeLa细胞在小鼠体内的成瘤能力.结果 荧光共聚焦显微镜显示突变型CHP2(CHP2-NESm)主要定位在HeLa细胞的细胞核内和细胞质,而野生型的CHP2主要定位于细胞质;MTT法结果 表明转染CHP2-NESm的HeLa细胞的活力显著强于转染野生型CHP2和空载体的细胞;软琼脂集落形成实验结果 表明,转染CHP2-NESm的HeLa细胞的集落数量和集落大小均明显大于转染野生型CHP2和空载体的细胞(P<0.05);体内实验结果 显示,转染CHP2-NESm的HeLa细胞较转染野生型CHP2的细胞的成瘤能力增强(P<0.05).结论 CHP2细胞核内的定位对调控HeLa细胞的增殖能力发挥重要的作用.
关键词： 核定位信号 细胞增殖 钙调磷酸酶B同源蛋白2 -
P21真核表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖的影响
目的:构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法:采用基因定点诱变技术获得核定位信号突变型P21基因.采用DNA重组技术,将突变型P21基因亚克隆至pDsRed1-C1真核表达质粒中,重组为pDsRed1-C1-P21NLS-.酶切鉴定及DNA测序,脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-P21NLS-的表达,荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位,台盼蓝拒染法检测质粒转染HepG2细胞生长曲线.结果:成功克隆了核定位信号野生型及突变型P21基因,成功构建TpDsRed1-C1-P21WT及pDsRed1-C1-P21NLS-重组质粒,酶切片段分别为4.7和0.5 kb,酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸序列数据库比对表明,核定位序列中共9个核苷酸发生变异,由CGAAAACGG突变为GCGGCCGCG,测序成功.高效表达的红色融合蛋白,野生型主要定位于细胞核:而突变型主要定位于细胞质.野生型P21抑制HepG2细胞的生长;突变型促进HepG2细胞的生长,二者差异具有统计学意义(P<0.01).结论:P21的亚细胞定位,对HepG2细胞增殖影响具有明显差异.胞核P21抑制肿瘤生长,而胞质P21促进肿瘤生长.
-
HCV NS5A反式调节蛋白13研究进展
HCV NS5A反式调节蛋白13(HCV NS5A trans-regulated protein 13,NS5ATP13)又称核螺旋体磷酸化蛋白1(nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1,NOLC 1)或核仁磷酸化蛋白140(nucleolar phosphoprotein 140,Nopp140),是Meier等在大鼠肝细胞核中发现并鉴定的一种核定位信号(nuclear localization signal,NLS)结合蛋白[1],作为蛋白伴侣具有细胞核与细胞质中穿梭的功能[2].本实验室在利用抑制性消减杂交的方法筛选HCV NS5A反式作用蛋白时,发现HCV NS5A可以上调该基因的表达[3].下面就NS5ATP13近年的研究进展作一综述.
-
基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造
目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并入核实现细胞水平的基因敲除.方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-SBP-Tat-EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS-Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21 (DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Western blot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果.结果:经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低.结论:利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除.
-
核定位信号结构特点及工作原理
核内的功能蛋白包括转录因子、剪接因子和其他的核蛋白,它们在胞浆中合成,通过本身的核定位信号与入核转运受体结合形成复合物,然后通过细胞核膜上的核孔复合体进入核内发挥它们的生物学功能.而要研究这些核蛋白的入核机制,可能会有许多问题萦绕脑中,例如:什么是核定位信号?它的结构特点是什么?它的工作原理是什么?通过什么样的方式才能预测核定位信号?入核转运的结构基础是什么?入核转运的影响因素有哪些?本篇综述通过核定位信号的结构和特点、影响核定位信号依赖的蛋白质入核转运的因素、入核转运的工作原理、入核转运的结构基础等几方面内容, 目的是使那些准备研究蛋白质入核机制,但是对核定位信号及其相关研究都不熟悉的研究者对核定位信号及其工作原理有个初步的认识,为将来的实验设计打下一个良好的基础.
-
成牙本质细胞中上游刺激因子1的表达、细胞内定位及转位研究
目的 检测成牙本质细胞中上游刺激因子1(upstream stimulatory factor-1,USF1)蛋白的表达及细胞内定位,并探讨其能否发生核转位.方法 培养成牙本质细胞MDPC-23,一组作为对照组不给刺激,另一组作为实验组经不同浓度尼古丁硫酸盐(25、50、75及100 mg/L)刺激1 h后分别制备细胞爬片,用抗USF1抗体,常规SABC法检测,以Hela细胞为阳性对照.结果 对照组(?)成牙本质细胞质中有较强的黄褐色颗粒,但100 mg/L尼古丁作用组胞核中有较强的黄褐色着色,胞质着色减弱,其他刺激组仅表现为胞质黄褐色,而阳性对照Hela细胞核中有较强的黄褐色着色.结论 体外培养的成牙本质细胞中有USF1蛋白表达,定位于细胞质、在尼古丁的刺激下可发生核转位.
-
核定位信号的研究进展
核定位信号(nuclear localization signal, NLS)是一种存在于细胞内许多蛋白质中、并介导蛋白质由细胞质向细胞核内转运的氨基酸序列.此氨基酸序列具有多样性,其作用机制也各有不同.它的核输入(nuclear import)作用受多种因素的调节.目前,核定位信号已被应用于功能研究及疾病的治疗等方面.
-
超声靶向微泡联合肽核酸结合核定位信号肽增强基因转染的实验研究
目的 应用超声靶向微泡破坏(UTMD)介导连接有核定位信号(NLS)的质粒DNA转染293T细胞,增加基因入胞及入核量,从而提高细胞对外源基因的转染效率.方法 合成连接有细胞特异性抗体的靶向微泡,特异性识别293T细胞膜表面SV40T抗原,强化UTMD空化作用使细胞膜通透性增加,从而提高质粒入胞率;通过肽核酸(PNA)将NLS与增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP-N3)基因交联,构建一种基因传递系统介导细胞核对外源基因的摄取.转染后比较以下几组间转染效率:空白对照组(A组)、普通微泡+质粒组(B组)、靶向微泡+质粒组(C组)、普通微泡+ NLS-PNA-DNA组(D组),靶向微泡+NLS-PNA-DNA组(E组).倒置荧光显微镜观察荧光分布情况;CCK-8检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞转染率;RT-PCR以及Western blot检测目的基因mRNA和蛋白的表达水平.结果 UTMD联合靶向微泡可显著提高胞质对外源性DNA的摄入,且细胞存活率均＞80％;倒置荧光显微镜示细胞内绿色荧光表达量依次递增;流式细胞仪检测五组基因转染效率分别为0、(9.30±0.46)％、(26.46±2.01)％、(29.54±0.62)％、(45.72±1.86)％,差异均有统计学意义(P均＜0.05);E组EGFP的mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于C、D组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 UTMD介导靶向微泡和连接有核定位信号的质粒DNA可明显增加细胞对质粒DNA的摄取表达,显著提高外源基因的转染效率.
-
超声靶向微泡破坏联合经典核定位信号肽促进基因转染的实验研究
目的：利用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术联合经典核定位信号肽(cNLS)促进目的基因入核,提高转染效率。方法用不同的方式将增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)转入293T 细胞。实验分4组：UTMD+pEGFP (对照组),UTMD+pEGFP+cNLS (经典型组),UTMD+pEGFP+mNLS (突变型组)和 UTMD+pEGFP+cNLS+WGA (入核阻滞组)。NLS 和 pEGFP 分别用 FITC 和Cy3标记。转染6 h 后,流式细胞仪检测 Cy3阳性细胞百分比作为质粒入胞率,激光共聚焦显微镜观测细胞核中 Cy3荧光强度占整个细胞荧光强度百分比作为质粒的入核率。转染48 h 后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8检测细胞存活率,RT-PCR 和 Western blot 分别检测 mRNA 和蛋白的相对表达量,并比较上述指标在4组间的差异以评价 cNLS 在 UTMD 介导基因转染中的作用。结果①转染6 h 后,带绿色荧光标记的 NLS 在细胞内不同部位显示,经典型组大量入核,突变组细胞质和细胞核均可显示,入核阻滞组主要聚集在细胞质,未能入核；②转染6 h 后,4组质粒的入胞率分别为(61±11)%、(80±10)%、(55±9)%和(58±10)%；入核率分别为(20±4)%、(50±11)%、(18±3)%和(10±3)%,经典组入核率和入胞率高,入核阻滞组低,差异有统计学意义(P <0.05)。③转染48 h后,4组细胞活性均>80%；转染效率、mRNA 和蛋白相对表达量均在经典组高,入核阻滞组低,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论 UTMD 联合 cNLS 能提高 pEGFP 入核率,从而提高目的基因转染效率。
-
联合超声靶向破碎微泡与PEI/DNA/NLS复合物构建新型基因转导体系提高基因转染效率的实验研究
目的 通过超声靶向破碎微泡技术与阳离子聚合物/目的基因质粒DNA/核定位信号(PEI/DNA/NLS)复合物联合构建新型基因转导体系,并评价用该体系转染293T细胞的转染效率.方法 用琼脂糖凝胶试验检测PEI/DNA/NLS复合物是否构建成功以及PEI/NLS对质粒DNA是否存在保护作用.利用超声基因转染仪作用于质粒DNA、PEI/DNA复合物,PEI/DNA/NLS复合物,声诺维微泡(SonoVue) /DNA,SonoVue/PEI/DNA复合物以及SonoVue/PEI/DNA/NLS复合物的六组293T细胞30s后,于细胞培养箱内培养24 h后,分别通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪来观察绿色荧光蛋白的表达情况及转染效率.同时使用CCK-8试剂检测超声靶向破碎微泡(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)联合PEI/DNA/NLS复合物的基因转导体系转染293T细胞后的细胞活性.结果 ①利用静电吸附作用成功构建了PEI/DNA/NLS复合物,琼脂糖凝胶电泳实验证明PEI以及NLS具有保护DNA不被核酸内切酶降解的作用,但此保护作用有时间限制.②UTMD+ PEI/DNA/ NLS复合物组在体外介导EGFP基因的转染效率优于UTMD+ PEI/DNA复合物组以及PEI/DNA/NLS 复合物(P＜0.05).③超声波的机械损伤以及PEI的化学毒性会造成细胞的损伤,但是各组之间细胞的活性差异无统计学意义.结论 UTMD联合PEI/DNA/NLS复合物构建新型基因转导体系可以提高基因的转染效率,从而提高基因治疗的效率.该基因转导体系有望为成临床基因治疗提供新的高效转染技术.
-
超声靶向破坏微泡联合核定位信号肽增强基因转染治疗犬心肌梗死的实验研究
目的 利用超声靶向破坏微泡(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽提高人血管生成素-1(hAng-1)基因体内转染效率,治疗犬心肌梗死.方法 46只犬经股动脉明胶海绵栓塞法成功建立急性心肌梗死模型后随机分为4组,每组 10只:①空白对照(A)组;②hAng-1(B)组;③UTMD+hAng-1(C)组;④UTMD+NLS + hAng-1(D)组.模型建成后1周,经静脉注入各组治疗试剂,同时C、D组超声辐照心前区.建模前、建模后1周基因转染前及转染后28 d分别行超声检查,二维超声心动图检测各组犬射血分数及室壁运动情况,心肌声学造影检测各组犬梗死及周围区心肌血流灌注情况.转染后28 d,RT-PCR和Western Blot检测hAng-1基因相对表达量;免疫荧光SP法定位新生毛细血管,显微镜下计数新生毛细血管密度(MVD);Masson染色及心脏大体标本评价梗死区纤维化程度及面积;比较4组基因治疗效果.结果 ①建模前,4组犬室壁运动、心功能正常,心肌造影各室壁未见充盈缺损.心肌梗死建模后1周基因转染前,4组犬室壁运动幅度及射血分数均明显减低,心肌造影均显示充盈缺损,组间差异无统计学意义(P>0.05).基因转染后28 d,A、B、C、D组心功能依次增高,C、D组与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05).心肌造影D组可见较多造影剂充填,C组少许造影剂充填,A、B组造影剂充盈缺损.②RT-PCR和Western Blot显示D组hAng-1基因表达量明显高于其他组,C、D组与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05).③免疫荧光SP法结果显示A、B、C、D组MVD依次增大,C、D组与其他各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05).④Masson染色及心脏大体标本显示心肌纤维化程度及面积A~D组依次减低.结论 NLS肽能促进UTMD介导hAng-1基因在缺血心肌内的高效表达,为缺血性心脏病的基因治疗提供新方法.
-
核定位信号肽在超声靶向微泡破坏介导基因转染中的增强效应
目的：利用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽促进增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)入核,提高 UTMD 介导基因的转染效率。方法实验分3组：UTMD+pEGFP 组(A 组)、UTMD+ NLS 肽+ pEGFP 组(B 组)和阳离子脂质体 Lipo3000+ pEGFP 组(C组)。FITC 荧光标记 NLS,核酸染料 Cy3标记 pEGFP,调整 NLS 肽与 pEGFP 不同摩尔比,观测两者佳结合比值。以佳超声辐照参数及 NLS 肽/pEGFP 摩尔比转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。转染6 h 后,用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别评价 Cy3标记质粒的入胞率和入核率。转染48 h 后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8检测细胞存活率,RT-PCR 和 Western 分别检测 mRNA 和蛋白的相对表达量,并比较三组间的差异以评价 NLS 肽在 UTMD 介导基因转染中的增强效应。结果①转染6 h 后,带绿色荧光的 NLS 肽和红色荧光的 pEGFP 均能在细胞同一部位显示且强度信号一致,提示两者相互结合；琼脂糖凝胶电泳示佳 NLS 肽/pEGFP 结合摩尔比为104∶1。②转染6 h 后,A、B、C 三组质粒的入胞率分别为(63±12)%、(80±10)%和(92±8)%,入核率分别为(17±3)%、(50±12)%和(35±8)%,差异均有统计学意义(P 均<0.05),B 组入胞率和入核率分别为 A 组的1.3倍和2.9倍, C 组分别为 A 组的1.5倍和2.1倍。③转染48 h 后,三组细胞活性均>80%,转染效率、mRNA 和蛋白表达的相对量均依次增加,差异均有统计学意义(P 均<0.05),B 组分别为 A 组1.6倍、2.3倍和2.4倍,但仍低于 C 组。结论 NLS 联合 UTMD 能提高 pEGFP 入核率,从而提高转染效率,NLS 肽发挥增强效应为 UTMD 介导转染提供新策略。
-
嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*的构建与鉴定
目的 构建携带FLAG-3NLS-FRB*融合基因的嵌合腺病毒,并检测其在AD-293细胞中的表达.方法 将FLAG标记的3段核定位信号(FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB*,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,感染AD-293细胞进行包装、扩增.采用基因转移单位(Gene transfer unit,GTU)法测定病毒滴度；RT-PCR及Western blot检测FLAG-3NLS-FRB*在AD-293细胞中的转录及表达.结果 腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB*经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确；FLAG-3NLS-FRB*正确克隆至腺病毒骨架质粒中；在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,病毒滴度为2.0×1013 GTU/ml；嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36 h,在细胞中可检测到FLAG-3NLS-FRB*基因的转录和蛋白的表达.结论 成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB*融合蛋白.
-
Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建
目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体.方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达栽体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况.结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核:而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中.结论:三顺反子表达栽体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础.
