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FRB文献资料
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嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*的构建与鉴定
目的 构建携带FLAG-3NLS-FRB*融合基因的嵌合腺病毒,并检测其在AD-293细胞中的表达.方法 将FLAG标记的3段核定位信号(FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB*,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,感染AD-293细胞进行包装、扩增.采用基因转移单位(Gene transfer unit,GTU)法测定病毒滴度；RT-PCR及Western blot检测FLAG-3NLS-FRB*在AD-293细胞中的转录及表达.结果 腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB*经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确；FLAG-3NLS-FRB*正确克隆至腺病毒骨架质粒中；在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,病毒滴度为2.0×1013 GTU/ml；嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36 h,在细胞中可检测到FLAG-3NLS-FRB*基因的转录和蛋白的表达.结论 成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB*融合蛋白.
