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用肽核酸快速检验、鉴定和计数瓶装水中的铜绿假单胞菌
Stender H.等人在2000年11月美国出版的《微生物方法杂志》上，介绍了一种新的同时检测、鉴定和计数铜绿假单胞菌的CISH (Chemiluminescent in situ hybridization)方法，该方法已经研究成功。这种检验方法用一个工作日就可以完成上述工作。用大豆过氧化酶标记的肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)为探针结合铜绿假单胞菌的种特异性rRNA，单个的铜绿假单胞菌菌落标记5小时后，可直接在滤膜上找到。每种微生物的过氧化酶作用物都会发光，这个现象可以通过胶片或数码相机系统看到。每一个光点都是一个铜绿假单胞菌。通过对28株铜绿假单胞菌和17株其他菌包括种属关系非常相近的菌的实验证实，该方法的灵敏度和特异性均为100%。而且，铜绿假单胞菌可通过发光点进行计数。作者认为PNA CISH发光法与传统的薄膜过滤技术相比，PNA探针特异性技术使实验结果又快又准确。(王晓玲供稿 郑云雁校)
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肽核酸的特性及作用
肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)是一类DNA结构类似物,能与DNA和RNA特异性杂交.它通过与DNA结合而抑制基因转录,通过与mRNA结合而阻止蛋白质的合成;同时,PNA不易被核酸酶和蛋白酶降解.所有这些显示出其作为反基因药物和反义药物的良好应用前景.
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肽核酸阻断PYR复合体与DNA位点结合对γ-珠蛋白基因表达的影响
目的:探讨肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)阻断PYR复合体(polypyrimidine complex)与DNA序列结合对γ-珠蛋白基因表达的影响.方法:设计并合成PYR-PNA、β-PNA和RS-PNA(随机序列PNA),以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将PNA转染到K562细胞中.用RT-PCR和Western blot技术分别在转录水平和蛋白翻译水平检测K562细胞在转染24、48和72 h后γ-珠蛋白基因的表达情况.结果:PYR-PNA组在转染24、48和72h后γ-珠蛋白基因mRNA和蛋白表达水平均显著高于RS-PNA组和空白对照组(P＜0.05),其中以转染48h后的表达上调为明显,分别为空白对照组的2.0和2.5倍.结论:PYR-PNA可显著上调K562细胞中γ-珠蛋白基因的表达;本研究为β-地中海贫血基因治疗提供了新的研究思路.
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肽核酸抑制HBV抗原表达的研究
肽核酸(Peptide Nucleic Acids,PNAs),是20世纪90年代初发现的新型DNA/RNA同类物,是一类人工合成的用蛋白质骨架代替核酸中的磷酸核糖骨架而形成的新型分子,由于它拥有诸多DNA/RNA不具有的优点,因此具有非常广泛的生物学效应.本研究的主要目的就是研究PNA片段对HBV抗原系统的抑制,从而筛选高抗原抑制率的PNA片段,为进一步研制有效的抗病毒药物提供依据.
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肽核酸压电基因传感器阵列检测乙肝病毒的研究
随着声光技术、微电子技术的迅速发展,一种基于石英晶体的压电现象发展而来的石英谐振式基因传感器逐渐发展成熟起来,它是以压电石英晶体为换能器、以特异性短核酸探针为分子识别元件的一种新型基因传感器,在它诞生之初就因为集合了核酸探针杂交的高特异性和石英晶振微天平的高灵敏性可能成为新一代基因诊断技术.但是,目前研究报道的基因传感器表面固定的都是DNA探针,形成一些难以克服的困难.
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核苷酸衍生物相关技术在分子诊断中的应用与展望
近年来,一些人工合成的核苷酸衍生物,包括肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid,HNA)等开始在分子诊断领域中得以应用[1].与普通的核苷酸(DNA、RNA)一样,这些衍生物由A、T、C、G四种碱基组成,可通过碱基配对原则与互补的核酸序列结合.这些人工合成的核苷酸衍生物有诸多自身优势,如较高的热稳定性、酶抵抗性等.籍此,其可以明显改善普通分子生物学技术的性能特点,包括灵敏度、特异性、重复性等.譬如,利用3’端LNA修饰的引物可显著提高单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测的特异性,利用PNA夹止技术的抑制作用,可选择性扩增高野生背景中的少量突变[2,3].
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肽核酸荧光原位杂交技术在临床微生物快速鉴定中的应用进展
肽核酸(peptlde nucleic acid,PNA)探针荧光原位杂交技术是一种诊断新技术,既具有PNA探针杂交的高度专一性,又具备传统染色技术的简便性,可为传染性疾病提供准确的诊断信息.它适用于临床微生物实验室的常规检验,能在短时间内为临床医生提供抗生素使用依据,具有传统微生物检验技术无法比拟的优势.笔者就其在临床微生物快速鉴定领域应用作简要综述.
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肽核酸对大肠癌LS-174T细胞生长抑制作用
目的:探讨肽核酸(peptide or polyamide nucleic acid,PNA)对大肠癌细胞端粒酶活性的抑制作用及对大肠癌细胞生长的影响.方法:应用脂质体Lipfectamine TM介导不同浓度(25,50,100,200,400 nmol/L)PNA-DNA杂交混合物转染LS-174T细胞.通过细胞克隆生长抑制试验来测定PNA对细胞生长的佳抑制剂量;选用佳抑制剂量PNA转染LS-174T细胞,同时设置脂质体组(Lipfectamine TM)组和空白对照组,观察克隆形成率、细胞形态及群体生长差异.结果:PNA对LS-174T细胞佳抑制浓度为200 nmol/L.PNA实验组端粒酶活性和克隆形成率明显低于脂质体组和空白对照组(0.003±0.001 vs 2.334±0.025,2.528±0.032,P<0.01;5.20% vs 45.45%,47.13%,P<0.01).PNA组癌细胞生长出现典型形态学改变,细胞变圆、胞膜皱缩、细胞核边集于核膜,通过群体生长曲线,转染后11d出现抑制作用,15、17d抑制作用显著.结论:体外试验中PNA对大肠癌LS-174T细胞生长有明显的抑制作用.其作用机制可能是PNA对大肠癌细胞端粒酶活性的抑制.
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PNA与DNA探针对漏声表面波传感器特异性的影响
目的 探讨以PNA作为杂交探针与普通的DNA探针相比,在漏声表面波生物传感器生物杂交反应中的优越性.方法 用巯基固定法将PNA、DNA两种探针分别固定在漏声表面波生物传感器的金膜表面,分别与完全匹配、1个及2个碱基错配的靶序列进行杂交反应,观察两种不同的探针与靶序列反应所引起的相位变化及反应平衡时间.结果 与DNA探针相比,PNA探针识别碱基错配的能力显著提高,且杂交平衡时间更短.结论 PNA探针可提高漏声表面波生物传感器的检测特异性.
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乙型肝炎病毒靶序列浓度对新型肽核酸压电基因传感器阵列的影响
目的探索乙型肝炎病毒(HBV)靶序列浓度值对肽核酸压电基因传感器阵列杂交效应的影响.方法压电基因传感器阵列表面先固定上1.5μmol/L的bis-PNA探针,观察终浓度为1pg/L至100μg/L的HBV DNA与探针,进行杂交所引起的频率变化及反应所需时间.并对频率下降值与靶序列浓度做线性回归,确定其线性范围.结果靶序列浓度为1pg/L时,传感器未能检测出任何频率的改变.随着浓度从10 pg/L增加到100μg/L,杂交反应引起的频率下降值呈先增加后趋于缓和的趋势,以10μg/L为分界线,而杂交平衡时间并没有显现出一定的变化趋势.在10pg/L到10μg/L的浓度范围内,浓度与频率下降值的线性回归方程为lgC=-2.7455+0.0691×△F,相关系数r=0.9923.结论随着靶序列浓度的升高,杂交反应引起的频率下降值呈典型饱和曲线趋势,靶序列浓度的线性检测范围为10pg/L～10μg/L.
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一种新型肽核酸基因传感器阵列检测系统的构建
目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)的肽核酸(PNA)压电基因传感器(PGS)阵列检测系统. 方法设计针对HBV的bis-PNA探针,将其固定在PGS阵列表面,具体摸索了bis-PNA探针与HBV基因组DNA杂交时的佳pH值、佳离子浓度、佳探针固定量,并结合自激式振荡电路,PESA V2.0频率记录分析软件构建出PNA-PGS阵列检测系统. 结果杂交缓冲液pH值为6.8、离子浓度为20 mmol/L、探针浓度为1.5 μmol/L时杂交条件为适宜. 结论成功地构建出了HBV PNA-PGS阵列检测系统,为临床标本中HBV的直接检测奠定了良好的实验基础.
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漏声表面波生物传感器检测系统构建时靶序列浓度的影响
目的 探讨新型的漏声表面波(LSAW)传感器检测系统构建时,人乳头状瘤病毒(HPV)靶序列浓度对其杂交效应和反应时间的影响.方法 LSAW传感器表面先固定上1.0 μmol/L的肽核酸(PNA)探针,观察终浓度为1 pg/L～1 mg/L的HPV靶序列DNA与探针进行杂交所引起的相位变化及反应所需时间,并对相位下降值与靶序列浓度做线性回归,确定其线性范围.结果 随着靶序列浓度从1 pg/L增加到1 mg/L,杂交反应引起的相位下降值呈先增加后趋于缓和的趋势,以100μg/L为分界线,而杂交平衡时间并没有显现出一定的变化趋势;在1 pg/L～100μg/L的HPV靶序列浓度范围内,相位变化与靶序列浓度的线性回归方程为△P=2.3392 1gC+14.584,相关系数r2=0.9622.结论 随着靶序列浓度的升高,杂交反应引起的相位下降值呈典型饱和曲线趋势,靶序列浓度的线性检测范围为:1 pg/L～100μg/L.
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反义肽核酸逆转人神经母细胞瘤多药耐药性的实验研究
目的探讨反义肽核酸(PNA)的细胞转染方法及对体外培养的神经母细胞瘤多药耐药性(MDR)的逆转作用.方法以人MDR-1基因mRNA为靶点设计合成两反义PNA序列,利用PNA-DNA杂交,阳离子脂质体介导转染神经母细胞瘤耐药细胞株SK-N-SH.应用流式细胞术、RT-PCR、MTT等方法分别检测反义PNA的转染效率、转染前后细胞P-糖蛋白(P-gp)、MDR-1基因mRNA的表达以及对化疗药物的敏感性.结果荧光标记的反义PNA转染肿瘤细胞后,细胞平均荧光强度显著增强,且呈浓度依赖性.两反义PNA均使SK-N-SH细胞P-gp表达明显降低,阿霉素和长春新碱对细胞的半数抑制浓度值明显下降,MDR-1 mRNA表达轻度降低.而PNA1转染对照组C6/adr细胞后,上述变化不明显.结论PNA-DNA杂交阳离子脂质体转染法可有效增加细胞对PNA的摄取,特异序列的反义PNA可有效逆转神经母细胞瘤的MDR特性.
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肽核酸的固相合成方法
肽核酸(PNA)作为一类很有发展前景的非天然的反义核酸,其高效合成是将其广泛应用的基础.本文从PNA单体的合成和PNA寡聚体的合成两方面对近几年PNA的固相合成作了系统的介绍.
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肽核酸的细胞传递
肽核酸(PNA)是第三代反义和反基因药物的代表.它是具有类多肽骨架的DNA类似物,在生物环境中非常稳定,与互补RNA和DNA有高度亲和性.PNA的细胞传递较差,限制了其作为基因表达调控剂的发展.目前已发展多种PNA的细胞传递方法,包括微注射法、电致孔、与DNA共转染、与脂溶性基团结合、与肽结合等.PNA在DNA细胞传递中有协同作用.
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肽核酸研究进展
序列选择性作用于核酸的试剂在分子生物学和药物化学领域有重要意义,因为它们有望成为定靶于基因的诊断和治疗药物.其中,寡核苷酸(ONs)有好的识别特异性和亲和性,它通过Watson-Crick碱基配对与含互补序列的单链核酸结合形成双螺旋结构,或以Hoogsteen或反Hoogsteen氢键结合到有特定序列的双链DNA(dsDNA)大沟处,形成三股螺旋,从而干扰基因的表达.随着人们对各种致病基因的了解,原则上人们可以设计出针对某个致病基因的寡核苷酸序列,利用它来抑制该基因的表达,达到诊断和治疗疾病的目的.
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肽核酸的研究与应用
目的介绍肽核酸的研究与应用进展,为其进一步研究与开发提供参考.方法以国内外发表的论文为材料,对肽核酸的分子结构、理化性质、与核酸结合的特点、对基因表达的调节作用等方面的数据进行分析.结果与结论肽核酸目前已成为一类新的分子生物学研究的有力工具,在基因表达、调控PCR扩增、分子杂交、基因突变分析、端粒酶长度分析和遗传病、肿瘤、病毒感染等疾病的基因诊断与基因治疗中有广泛的应用前景.
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修饰性肽核酸的合成研究进展
肽核酸(PNA)是一类以多肽骨架替代DNA的戊糖磷酸骨架的寡核苷酸类似物,基本的骨架是N-(2-氨基乙基)甘氨酸.肽核酸具有良好的理化性质和生物学特性,如稳定性高、杂交特异性强、不被核酸酶和蛋白酶水解等,但其水溶性差,细胞膜通透性低.笔者从骨架、碱基、骨架和碱基的连接方式与位置等方面对修饰性肽核酸的合成研究进展进行综述,使肽核酸具有更好的应用前景.
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反义肽核酸阻断人神经母细胞瘤多药耐药相关蛋白P-糖蛋白的表达
目的探讨反义肽核酸(PNA)的细胞转染方法及其对体外培养的神经母细胞瘤多药耐药(MDR)相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法以人MDR-1基因mRNA为靶点设计合成两反义PNA序列,利用PNA-DNA杂交,阳离子脂质体介导转染神经母细胞瘤耐药细胞株SK-N-SH.采用流式细胞术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和高效液相色谱等方法分别检测反义PNA的转染效率,转染前后细胞P-gp、MDR-1基因mRNA的表达及细胞内阿霉素(ADM)浓度.结果荧光标记的反义PNA转染肿瘤细胞后,细胞平均荧光强度显著增强,呈浓度依赖性.两反义PNA均使SK-N-SH细胞P-gp表达明显降低,MDR-1 mRNA表达轻度降低,细胞内ADM聚集浓度明显增加.结论PNA-DNA杂交阳离子脂质体转染法可有效增加细胞对PNA的摄取,特异序列的反义PNA可在一定程度上阻断神经母细胞瘤MDR相关蛋白P-gp的表达.
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反义肽核酸的研究进展及应用
反义肽核酸是人工合成的DNA类似物,与核酸分子比较,具有较高的水溶性、稳定性和碱基特异性,容易被细胞吸收.反义肽核酸与DNA形成的三联体结构可阻断基因的转录和翻译,还可通过抑制DNA引物的延伸而抑制基因的复制过程.反义肽核酸作为第三代基因治疗制剂,已用于体外抑制肿瘤细胞的生长,以及细菌或病毒感染性疾病的治疗.另外,反义肽核酸还用于对免疫分子和细胞因子的研究,从而促进了器官移植和免疫学的发展.此外,作为一个有力的分子生物学工具,它还用于荧光原位杂交等技术,对于疾病的诊断、基因功能的研究有很重要的意义.
