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荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎β-地中海贫血基因诊断
目的用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法进行种植前β-地中海贫血一种中国人常见突变类型CD41/42(-TCTT)的基因诊断. 方法来源于β-地中海贫血病人或携带者的289个淋巴细胞和人体外受精-胚胎移植志愿者剩余的胚胎分离137个单细胞用荧光定量PCR方法进行分析. 结果用单个淋巴细胞诊断β-地中海贫血扩增效率达96 %,准确率达99 %～100 %,等位基因丢失(ADO)率仅0～5 %.单个胚胎细胞扩增效率86 %. 结论荧光定量PCR技术是一种敏感、快速、可靠和准确的技术,适合包括β-地中海贫血在内的单基因疾病的种植前诊断.
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小儿重型β-地中海贫血肝穿刺活检病理特点及评价
目的探讨重型β-地中海贫血患儿肝脏病理改变特点及其与临床的关系,评价肝活检病理对治疗指导的意义.方法对22例重型β-地中海贫血患儿行肝活检病理检查,并结合临床资料进行分析.结果22例穿刺均1次成功,肝组织有不同程度的铁沉积,沉积程度与输血量及血清铁蛋白相关.汇管区纤维组织增生,纤维化程度与铁沉积程度无相关.结论我国重型β-地中海贫血患儿肝病理变化的特点是铁沉积重,纤维化程度相对轻.小儿肝穿刺活检是安全、可行的.
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中医药治疗β-地中海贫血的表观遗传学研究
参考β-地中海贫血表现遗传学的国内外研究进展情况并结合广安门医院吴志奎教授课题组对地中海贫血近30年的临床与实验研究,主要从DNA甲基化、组蛋白共价修饰、红系转录因子与表现遗传学修饰作用以及非编码RNA方面总结了中医药治疗β-地中海贫血可能的表现遗传学机制,为深入探讨中中药治疗β-地中海贫血提供另一层次理论基础,为临床β-地中海贫血的治疗提供新思路.
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"益髓生血灵"对不同发育阶段小鼠血红蛋白珠蛋白表达的影响
目的:探讨益髓生血灵对不同发育阶段小鼠珠蛋白表达的影响.方法:分别提取正常成年小鼠骨髓、孕鼠(孕21d)和胎鼠(孕14d)胎肝胎脾有核细胞总RNA,采用real-time PCR方法检测中药益髓生血灵干预后对不同发育阶段小鼠的βminor基因(类似于人γ-珠蛋白基因)表达的影响.结果:中药干预后,胎鼠(孕14d)的βminor珠蛋白基因的表达没有明显改变;孕鼠(孕21d)和正常成年鼠造血组织βminor珠蛋白基因的表达量明显提高,与对照组相比存在显著性差异(P＜0.05,P＜0.01).结论:益髓生血灵治疗β-地中海贫血的分子机制之一,是可能改变珠蛋白程序性表达,开启在出生前本应关闭的γ-珠蛋白基因,增加HbF的合成而达到治疗效果.
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益髓生血颗粒对不同发育阶段小鼠α-血红蛋白稳定蛋白表达的影响
目的:探讨益髓生血颗粒对不同发育阶段小鼠α-血红蛋白稳定蛋白(alpha-hemoglobin stabilizing protein,AHSP)表达的影响.方法:分别提取正常成年小鼠骨髓、孕鼠(孕21 d)和胎鼠(孕14 d)胎肝胎脾有核细胞总RNA,采用real-time RT-PCR方法检测中药益髓生血颗粒干预后对不同发育阶段小鼠的α-珠蛋白稳定蛋白基因表达的影响.结果:中药干预后,胎鼠(孕14 d)、孕鼠(孕2l d)的AHSP基因表达无明显改变,而成年鼠骨髓AHSP基因表达明显上调.结论:益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血的可能分子机制之一,是通过促进AHSP基因的表达,减少游离α-珠蛋白的沉积,遏止其对红细胞的毒害作用,减少溶血发生而达到治疗效果.
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益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血156例临床观察
目的研究益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血临床效果及安全性.方法在广西高发区用益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血,疗程3个月,观察治疗前后临床症状、Hb、RBC、网织红细胞(Ret)、抗碱血红蛋白(HbF)水平变化并进行停药后3～6个月随访及不良反应的观察.结果治疗组患者自疗程第1个月起至3个月结束,Hb、RBC、Ret、HbF等各项血液学参数均有提高,与治疗前比较差异有显著性(P＜0.01);中医临床症状改善及动态观察与血液参数提高相一致,与治疗前比较差异有显著性(P＜0.01);156例中有效145例,无效11例,总有效率达92.9%.未见明显的不良反应.停药后随访结果显示,疗效维持时间3～4个月.结论益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血疗效显著,未见明显的不良反应.为中医药辨证治疗β-地中海贫血提供了一定的依据.
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孕妇小片段游离胎儿DNA进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断
目的:探讨利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA(cfDNA)进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断的临床价值.方法:本研究收集了来我院进行产前诊断可能生育重型β-地中海贫血的孕妇24例,抽取绒毛或羊水进行常规的地中海贫血的产前诊断,另外收集孕妇外周血液标本8～10 ml,均使用ACD抗凝,对cfDNA进行二次PCR反应后,对胎儿的β-珠蛋白基因型采取反向斑点杂交(RDB)检测,并与有创伤性产前诊断结果进行比较,分析其结果.结果:所有小片段cfDNA均可顺利扩增,父母基因型相同的8例标本中,诊断符合率为87.5％(7/8),1例正常胎儿误诊为携带者;父母基本型不同的16例标本中,诊断符合率为87.5％ (14/16),有2例误诊,其中1例正常胎儿误诊为β-地贫基因携带者,1例β-地贫基因携带者误诊为重型β-地贫患者.结论:利用cfDNA进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断具有良好的临床价值.
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益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血281例临床研究
目的 评价益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血(简称β-地贫)的临床疗效.方法 采用益髓生血颗粒治疗β-地贫患者281例,其中重型β-地贫患者63例[其中重型β-地贫复合血红蛋白E,简称重型(β+E)地贫18例,单纯重型β-地贫45例],中间型β-地贫218例[其中中间型β-地贫复合血红蛋白E,简称中间型(β+E)地贫患者35例,单纯中间型β-地贫183例],疗程3个月,比较281例患者治疗前后血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、网织红细胞(Ret)、胎儿血红蛋白(Hbr)的变化,对其中147例β-地贫患者治疗前后的中医证候(面色萎黄、头晕目眩、心慌心悸、动则气喘、倦怠乏力、食少纳呆)进行量化评分,并观察临床疗效.结果 治疗后四种类型的β-地贫患者Hb、RBC、HbF水平与治疗前比较均明显提高(P＜0.01);除重型(β+E)地贫患者Ret水平无明显变化(P＞0.05)外,单纯重型β、中间型(β+E)、单纯中间型β-地贫患者的Ret水平与治疗前比较均明显升高(P＜0.01).治疗后中间型β-地贫患者面色萎黄、头晕目眩、心慌心悸、动则气喘、倦怠乏力、食少纳呆的中医证候量化评分与治疗前比较明显降低(P＜0.01);重型β-地贫患者倦怠乏力、食少纳呆、心慌心悸、动则气喘的中医证候量化评分与治疗前比较明显降低(P＜0.05或P＜0.01).281例β-地贫患者中有效213例,占75.80％;其中45例单纯重型β-地贫中有效34例,占75.56％;18例重型(β+E)中有效16例,占88.89％;183例单纯中间型β-地贫中有效131例,占71.58％;35例中间型(β+E)中有效32例,占91.43％.结论 益髓生血颗粒对不同类型的β-地贫均有显著疗效,患者的临床症状改善与血液指标提高相一致.
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补肾益髓法治疗β-地中海贫血的现状
分析β-地中海贫血临床研究现状以及中医中药研究进展,重点介绍中国中医科学院广安门医院近30年来基于“肾藏精生髓理论”从肾论治地中海贫血的临床探索和基础实验研究,阐述中医中药治疗β-地中海贫血的理论依据、核心病机、治则治法以及疗效特点的可能分子机制,展望中医药治疗β-地中海贫血的前景和有待深入的研究方向.
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CRISPR/Cas9系统及其在血液病基因治疗中的研究进展
近年来随着基因编辑技术的兴起,可以实现对基因组中特定的基因进行编辑,使基因突变性疾病的治愈成为可能.在众多基因编辑技术中,CRISPR/Cas9系统因其操作简便性、靶向特异性、经济性等特点备受关注,已广泛应用于分子生物学以及生命科学的领域研究中.本文就此系统结构、作用机制以及在血友病、β-地中海贫血、慢性髓系白血病等血液病中基因治疗的新研究进展作一综述.
关键词： CRISPR/Cas9 血友病 β-地中海贫血 慢性髓系白血病 基因编辑 -
肽核酸阻断PYR复合体与DNA位点结合对γ-珠蛋白基因表达的影响
目的:探讨肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)阻断PYR复合体(polypyrimidine complex)与DNA序列结合对γ-珠蛋白基因表达的影响.方法:设计并合成PYR-PNA、β-PNA和RS-PNA(随机序列PNA),以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将PNA转染到K562细胞中.用RT-PCR和Western blot技术分别在转录水平和蛋白翻译水平检测K562细胞在转染24、48和72 h后γ-珠蛋白基因的表达情况.结果:PYR-PNA组在转染24、48和72h后γ-珠蛋白基因mRNA和蛋白表达水平均显著高于RS-PNA组和空白对照组(P＜0.05),其中以转染48h后的表达上调为明显,分别为空白对照组的2.0和2.5倍.结论:PYR-PNA可显著上调K562细胞中γ-珠蛋白基因的表达;本研究为β-地中海贫血基因治疗提供了新的研究思路.
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中国武汉地区新生儿β-地中海贫血基因型分析
目的:调查中国武汉地区新生儿β-地中海贫血基因型,以及分子流行病学特征.方法:采用PCR-流式荧光杂交法检测2721例地中海贫血初筛阳性的新生儿β-地中海贫血基因.结果:在中国武汉地区检测出新生儿β-地中海贫血537例,α-复合β-地中海贫血19例.β-地中海贫血以轻型为主;中间型1例,其基因型为-29/IVS-2-654;重型2例,其基因型分别为CD41-42/IVS-2-654和CD27-28/IVS-2-654.在537例β-地中海贫血患儿中检测出15种基因型,以点突变IVS-2-654/N229例(42.64％)、CD41-42/Ⅳ121例(22.53％)、CD17/N 76例(14.15％)、CD26/Ⅳ39例(7.26％)和CD27-28/N 27例(5.03％)为主,占β-地中海贫血的90％以上.β-地中海贫血基因频率IVS-2-654突变、CD41-42突变和CD17突变出现的频率高,其构成比分别为:42.93％、22.36％和14.13％.结论:中国武汉地区新生儿β-地中海贫血以轻型为主,其基因频率以IVS-2-654突变、CD41-42突变和CD17突变较高.
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中国云南汉族和傣族育龄人群的地中海贫血基因分析
目的:了解云南汉族和傣族育龄人群地中海贫血(简称地贫)的常见基因突变类型.方法:对血液学筛查阳性的小细胞低色素携带者或贫血患者DNA样本,采用Gap-PCR方法和PCR-寡核苷酸探针反向斑点杂交法检测α-或β-珠蛋白基因常见突变类型;采用DNA直接测序法检测可能存在的未知突变;统计分析云南汉族和傣族人群中珠蛋白突变的类型.结果:在685例受检者中共检出40种基因型,其中α-地贫携带者前3位的基因型分别是--SEA/αα(占49.09％)、-α 3.7/αα(36.67％)和αCSα./αα(8.79％);β-地贫携带者前3位的基因型分别是CD26(GAG＞ AAG)/N(43.78％)、CD41-42(-CTTT)/N(20.1％)和CD17(AAG＞ TAG)/N(18.9％).在685例样本中,汉族348例,傣族212例,这2个民族的珠蛋白基因常见突变顺位各有不同,但傣族人群中地中海贫血基因突变类型比较集中.在38例α--地中海贫血复合β-地中海贫血双重杂合子中,傣族就有28例.结论:云南人群中α-和β-珠蛋白基因突变类型的多样性较为丰富,突变谱与国内其他地区的人群不同.
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中国云南省两个边境地区傣族人群β-地中海贫血基因突变谱分析
目的:探讨云南省两个边境地区傣族人群β-地中海贫血基因突变类型构成.方法:对来源于德宏和西双版纳的傣族人群应用血红蛋白和血常规检测筛查地中海贫血,以PCR-RDB技术(反向点杂交技术)检测β-地中海贫血基因突变,分析比较两地傣族人群β-地中海贫血基因突变类型构成比.结果:确诊186例β-地中海贫血患者的基因突变,共检出10种突变类型,以CD26 (62.56％),CD41-42(18.97％),CD17(14.36％),CD71-72 (2.05％),IVS-II-654(1.54％)5种突变为主.在德宏地区傣族人群中检出4种突变类型,为CD26(80.31％),CD17(11.02％),CD41-42(6.30％)和CD71-72 (2.36％),在西双版纳地区傣族人群检出6种突变类型,以CD41-42(42.64％),CD26 (29.41％),CD17(20.59％)为多见.结论:β-地中海贫血基因突变在云南省傣族人群中存在较大遗传异质性,不同地区的傣族人群有明显差异.
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42例广东籍重型β-地中海贫血与HLA-DQB1*等位基因的相关性分析
为探讨HLA-DQB1*位点与β-地中海贫血的相关性,应用聚合酶链反应-序列特异引物(PCR-SSP)方法对42例无血缘关系的广东籍汉族重型β-地中海贫血患者进行HLA-DQB1*分型,同时随机检测45例广东籍正常人群作为对照.结果发现HLA-DQB1*06位点等位基因在β-地中海贫血患者群体中频率为19.0%,而对照组为4.4%,两组有显著性差异(χ2=8.961,P＜0.01).结论提示HLA-DQB1*06等位基因与广东地区β-地中海贫血的发病有关联.
关键词： β-地中海贫血 HLA-DQB1*等位基因 -
β-地中海贫血复合缺失型α-地中海贫血双重杂合子的分子检测及血液学分析
本研究对β-地中海贫血复合缺失型α-地中海贫血双重杂合子进行分子检测及血液学表型分析,以了解其检出情况及基因分布状况.采用单管多重gap-PCR技术检测3种常见的缺失型α-地中海贫血基因;采用PCR结合反向点杂交法检测β-珠蛋白基因17个位点的18种突变;进行血细胞常规分析.结果表明:81例β-地中海贫血杂合子中有15例复合缺失型α-地中海贫血,占18.52%.共有9种基因型,包括6例(7.41%)β-地中海贫血杂合子携带α-地中海贫血-1基因(--SEA/αα);8例(9.88%)携带α-地中海贫血-2基因,其中6例(7.41%)为右侧缺失型(-α3.7/αα),2例(2.47%)为左侧缺失型(-α4.2/αα);1例(1.23%)携带缺失型HbH基因(--SEA/-α3.7).β-地中海贫血复合缺失型α-地中海贫血双重杂合子的各项红细胞参数与单纯β-地中海贫血杂合子比较差异无显著性意义(P＞0.05).结论:梧州市β-地中海贫血复合缺失型α-地中海贫血双重杂合子的发生率很高,而血液学指标缺乏特异性.采用gap-PCR作为临床上地中海贫血筛查的一线方法,可以有效减少β-地中海贫血复合α-地中海贫血双重杂合子漏检的可能,对遗传咨询和准确进行产前诊断具有重要意义.
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羟基脲治疗中间型β地中海贫血的疗效观察
目的:研究中间型β地中海贫血患者的临床特点,羟基脲对中间型β地中海贫血患者的疗效以及不良反应.方法:将29例患者分为羟基脲治疗组及未接受羟基脲治疗的对照组,观察和对比两组患者的疗效,对不良反应及输血情况进行评估.结果:羟基脲治疗3个月后血红蛋白水平即有上升,网织红细胞数在羟基脲治疗1年后有明显下降,而血清铁蛋白一直维持在较低水平.未接受羟基脲治疗组患者治疗后血红蛋白及网织红细胞水平均无明显改善,而血清铁蛋白水平逐渐升高.羟基脲组患者在羟基脲治疗1年后有12例患者脱离输血,治疗有效率为85.71％,而未接受羟基脲治疗组患者在治疗后输血依赖情况未改善.所有接受羟基脲治疗的患者,经过随访1年未发生严重不良反应.结论:羟基脲对中间型β-地中海贫血具有较好疗效,患者无严重不良反应,其长期疗效以及其长远不良反应还有待继续观察.
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同胞脐血和同供者骨髓联合移植治疗儿童重型β-地中海贫血
为了研究同胞脐血和骨髓联合移植治疗儿童重型β-地中海贫血的疗效,用HLA全相合同胞脐血+骨髓移植治疗3例重型β-地中海贫血.供给3例受者的有核细胞细胞数分别为19.5×107/kg、20.8×107/kg和23.3×107/kg.移植的预处理方案:采用马利兰+环磷酰胺+抗胸腺细胞球蛋白方案.结果表明:3例患儿均获得长期稳定植入,中性粒细胞0.5×109/L的时间分别为16、18、17天,血小板50×109/L的时间分别为48、50、49天,造血重建速度较单纯脐血移植快.3例患儿现已脱离了地中海贫血状态生活了1.5、2.0、2.1年,血红蛋白一直维持在正常水平.3例患儿均发生Ⅰ度急性移植物抗宿主病(aGVHD).结论:同胞脐血和骨髓联合移植可能作为一种安全和有效的移植方式用于治疗儿童地中海贫血.
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地拉罗司治疗2~6岁重型β-地中海贫血铁过载一年安全性观察
目的：对一组年龄在2~6岁的重型β-地中海贫血患者应用地拉罗司治疗铁过载1年的安全性进行评估。方法采用单组、开放性实验设计，对26例受试患者服用地拉罗司，每月定期随访观察有无胃肠道反应，检测血清铁蛋白（SF）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP），血清肌酐（SCr），入组前检测尿蛋白定性结果、十二导联心电图（ECG）、左腕关节 X 线片计算骨龄、远视力检测方法检测视力、瞬态耳声发射（TEO-AE）进行听力检测。结果1年观察期结束未发现1例尿蛋白阳性、SCr 增高，视力损害，地拉罗司对骨龄没有影响；胃肠道反应轻微，恶心2例（占7.7％），腹痛4例（占15.4％）；ALT、AST 一过性增高多见，5倍以上正常值上限（ULN）增高3例（占11.5％）；视力一过性受损4例（占15.4％），1例为右耳蜗性受损。结论地拉罗司用于治疗2~6岁重型β-地中海贫血铁过载，临床总安全性较好，胃肠道反应轻微，肝转氨酶大多数一过性增高，5倍以上 ALT、AST 增高值可短时间停药再次服用不会继续升高，对肾功能和骨龄无影响。对听力的影响要密切关注，建议每3个月检测一次。
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骨髓MRI在重型β-地中海贫血造血干细胞移植中的价值
目的 探讨骨髓MRI在重型β地中海贫血造血干细胞移植(HSCT)中的价值.方法 对27例拟行HSCT重型地中海贫血患儿的股骨骨髓进行MRI检查.进行FSE的T1WI及T2WI、STIR、同相位及反相位快速场回波序列(FFE)股骨近段斜冠状位成像.在T1WI、T2WI及STIR图像上判断红黄骨髓的分布,并测量股骨近段红骨髓总面积及其百分比.在同相位、反相位FFE图像上序列判断骨髓是否有铁沉积.比较不同病情及不同移植结局患者的红骨髓面积及其百分比及骨髓内铁沉积,并与临床实验室指标进行相关性分析.运用Logistic回归分析红骨髓面积及其百分比、骨髓铁沉积与HSCT结局之间的关系.结果 27例重型地中海贫血中,10例出现骨髓铁沉积,骨髓铁沉积与临床指标无相关性(P>0.05),对HSCT结局无影响(P＝0.775).红骨髓面积及其百分比与病程及血清铁蛋白正相关(r=0.727、0.428,P<0.05;r=0.487、0.511,P＝0.01、0.006).27例中2例死于预处理,余25例进行了HSCT.进行HSCT的25例中,移植成功及移植失败病例中红骨髓面积及其百分比分别为(7.94±2.71) mm2(90.25%±4.14%),(10.54±3.31) mm2(94.54%±2.93%),两组之间均有统计学差异(P＝0.04、0.01).回归分析显示红骨髓面积百分比与HSCT结局密切相关(OR=1.383,P＝0.005).结论 MRI上股骨近段红骨髓面积百分比可作为重型地中海贫血HSCT病情分类的一个独立危险因素.
