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核酸探针和PCR技术在食品致病菌检验中的应用
随着我国经济的发展，人们生活水平越来越高，越来越重视食品安全问题，与此同时，食品安全检验技术也得到了广泛应用。由于传统的食品检验方法费时费力、繁琐、准确性低，人们开始致力于研发新的检测技术，其中核酸探针和PCR技术是近发展起来的两种食品安全检验高新生物技术，有着快速、敏感、准确的优势，具有很大的投资效益。
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Wallac 1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪维护
时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子(镧系元素:铕、铋、钐等)及其鳌合物为示踪剂来标记抗原、抗体、核酸探针或生物活性细胞等为特征的超灵敏度检测技术.三价稀土离子与抗原、抗体络合后,经过增强剂的增效处理,产生半衰期长、荧光度强的荧光,从而大大提高了检测的灵敏度.此方法具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、有效期长、标准曲线范围宽、不受自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点,已成为现代生物医学研究和临床超微量检验中的一项有发展前景的分析手段.目前是核素体外检测的顶尖技术和方法.
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新波时间分辨荧光仪原理及故障分析
时间分辨荧光仪是由苏州新波生物公司生产的,具有操作简单、性能稳定、快速准确等优点的仪器.现将仪器的测量原理及日常使用中的故障,分析如下.1测量原理通过应用三价稀土离子作为示踪物,标记蛋白质、多肽、激素等物质,待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤性反应等)发生后,用荧光分析仪测定后产物中的荧光强度,以此来判断反应体系中被测物质的浓度.
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荧光探针熔解曲线法检测结核患者N-乙酰基转移酶2基因型分布的应用评价
目的 评价荧光探针熔解曲线法检测结核病患者芳基胺N-乙酰基转移酶2(arylamine N-acetyl-transferases 2,NAT2)基因多态性的性能.方法 选取于2015-2016年到福州肺科医院和北京胸科医院确诊的初治结核病患者作为研究对象,分别为371例和355例.收集研究对象外周血标本.应用荧光探针熔解曲线法[分析NA T2基因rs1801280(341T→G)、rs1799929(481C→T)、rs1799930 (590G→ A)和rs1799931(857G→A)等4个单核苷酸多态性(SNP)]和DNA测序分析法[分析NAT2基因的rs1801279 (191G→A)、rs1041983 (282C→T)、rs1801280(341T→C)、rs1799929 (481C→T)、rs1799930 (590G→A)、rs1208 (803A→G)和1799931 (857G→A)的7个SNP位点]对研究对象进行NAT2基因型分析,并根据NAT2基因型进行NAT2代谢类型的推断分析.结果 荧光探针熔解曲线法分析4个SNP位点与DNA测序分析法分析7个SNP位点推断NAT2代谢类型的结果完全一致.荧光探针熔解曲线法从DNA制备、PCR扩增和熔解曲线分析的整个检测过程需要2.5h.共检测到NAT2*4/*4、NAT2*5/*4、NAT2*6/*4、NAT2 *7/*4、NAT2*5/* 11、NAT2*6/* 11、NAT2*7/* 11、NAT2*5/*6、NAT2*6/*7、NAT2*5/*5、NAT2*6/*6、NAT2*7/*7、NAT2*5/*7等13种NA T2基因型.福州肺科医院的结核病患者NAT2基因快乙酰化、中间乙酰化和慢乙酰化类型分别占37.20％(138/371)、42.32％(157/371)和20.49％(76/371);北京胸科医院的结核病患者中,快乙酰化、中间乙酰化和慢乙酰化类型分别占27.89％(99/355)、54.65％(194/355)、17.46％(62/355);两组人群的乙酰化类型分布差异有统计学意义(x2 =11.37,P=0.003).所有的快乙酰化代谢人群均携带NAT2*4/*4基因型[100.00％ (237/237)],而慢乙酰化代谢人群主要携带NAT2*6和NAT2*7的单倍型[90.22％ (249/276)].结论 荧光探针熔解曲线法分析4个SNP位点检测NA T2基因型具有结果判读简便、准确、快速的优点,适用于中国地区人群的NA T2基因型的检测.
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实时荧光核酸恒温扩增检测技术在继发性肺结核患者中的应用价值
目的 评价实时荧光核酸恒温扩增检测(simultaneous amplification and testing,SAT)技术在继发性肺结核患者中的临床应用价值.方法 收集2014年1月至2015年9月在黑龙江省传染病防治院结核内科住院的1036例临床诊断为继发性肺结核患者的晨痰样本,同时使用痰抗酸杆菌显微镜检查、分枝杆菌液体培养及SAT法3种技术进行检测.采用x2检验比较各方法间的阳性检出率,以P＜0.05为差异有统计学意义;用Kappa检验比较SAT与其他检测技术间的一致性.结果 SAT、痰涂片、液体培养3种检测方法的阳性检出率分别为55.02％(570/1036),47.30％(490/1036)和50.39％(522/1036),SAT法阳性检出率较涂片、液体培养分别高7.72％(80/1036)、4.63％(48/1036),差异有统计学意义(x2值分别为32.505、13.470,P值均＜0.05).SAT与涂片、培养方法比较K值分别为0.63、0.68.结论 SAT法较痰涂片和液体培养的阳性检出率高,与痰涂片和液体培养比较具有较高一致性,有助于快速筛查及诊治继发性肺结核.
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PCR及其相关技术在结核分枝杆菌检测中应用的研究进展
结核病近十几年来有死灰复燃之势[1],其主要原因是耐药菌株的增加和医源性感染的发生[2],因此加强结核分枝杆菌的检测对院内感染诊断和消毒效果评价有重要意义.
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利用TaqMan-MGB探针检测A(H3N2)亚型流行性感冒病毒E119V耐药突变
目的 建立快速检测A(H3N2)亚型流行性感冒病毒(简称流感病毒)神经氨酸酶(M)基冈E119V奥司他韦耐药突变位点的双重实时荧光定量逆转录PCR(rRT-PCR)方法.方法 由GenBank获取2000-2012年A(H3N2)亚型流感病毒NA基因序列26条,据此设计特异性靶向NA E119V突变位点的TaqMan-MGB探针进行双重rRT-PCR反应,并利用耐药参考株、临床分离株进行敏感性、特异性和重复性评价.结果 建立了快速检测NA基因E119V位点的双重rRT-PCR检测方法.本方法在A(H3N2)病毒(HA=8)稀释度至10-5仍可检测到荧光信号,病毒滴度的对数与Ct值之间呈线性相关,具有较高的灵敏度；与无耐药突变的A(H3N2)流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,两条TaqMan-MGB探针之问不存在交叉反应,具有很高的特异性,并能够检测耐药株和敏感株混合病毒中的耐药突变,在较高浓度的混合病毒中对耐药突变的检测限是5％,在低浓度混合病毒中的检测限是50％.重复性试验得到H3N2-119E和H3N2-119V两组探针批内平均变异系数(CV)值分别为2.32％和0.57％,批间CV值分别为1.77％和0.97％,具有较好的重复性.对其中20株病毒的NA基因序列进行分析,证实这些毒株的NA基因119位点均为谷氨酸(E),表明本研究设计的方法与序列测定结果一致.结论 建立了基于TaqMan-MGB探针检测A(H3N2)亚型流感病毒E119V耐药突变的双重rRT-PCR方法,该方法灵敏、特异、重复性好,实验过程和结果判读简单易操作.
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长臂光敏生物素和光敏地高辛核酸探针检测医学真菌灵敏度的比较研究
建立应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针杂交.检测真菌的方法, 并比较二者检测临床常见医学真菌的敏感性.设计并合成医学真菌通用引物, 用PCR扩增白色念珠菌标准株的核糖体RNA基因, 用长臂光敏生物素或光敏地高辛标记其纯化的扩增产物制备成相应的核酸探针, 然后用上述两种探针对标本中的PCR扩增产物进行Southern杂交, 检测医学真菌.通过用白色念珠菌感染大鼠, 建立念珠菌病的实验动物模型, 验证血培养法、PCR法和PCR扩增结合Southern杂交, 检测真菌的敏感性.结果表明,这两种核酸探针可分别与白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等9种真菌杂交呈阳性结果; 与临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA杂交结果为阴性.利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增结合长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度, 实验证明后者的敏感性高.总之, 应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针与标本PCR扩增物杂交, 检测上述真菌既特异和敏感, 又不需放射性同位素.光敏地高辛核酸探针检测医学真菌的灵敏度略高于长臂光敏生物素核酸探针.
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新型的电化学发光免疫分析及其临床应用
1990年Leland[1]等人建立了电化学发光反应系统之后，以电子得失过程中的电位差作能量激发源的电化学发光免疫分析(electrochemoluminescence immunoassay,ECLIA)相应建立。ECLIA与其他几种标记技术相比，有许多优点：(1)无放射性辐射危害，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应；(2)灵敏度高，检测线性范围在6个数量级，下限值为1pmol，达到或超过RIA水平；(3)检测速度快，检测仅需几分钟到十几分钟；(4)稳定性好，自动化程度高，可直接使用液体试剂；(5)应用范围宽，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。ECLIA符合临床检验的需要，为科研工作和临床诊断提供了一种痕量非放射性的免疫检测手段。
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锁核酸捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应构建及检测乙型肝炎病毒DNA
建立和检测新型乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测技术锁核酸(LNA)捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应(PCR)。方法 2009年8月至2010年3月选取本院20例健康献血者和肝病专科住院的75例经COBAS Amplicor检测HBV DNA阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,分别采集血液样本进行LNA捕获TaqMan探针实时PCR特异性试验。同时对LNA-实时PCR方法的重复性、特异性和线性范围等进行分析。结果 其线性范围为10～2.3×109 IU/ml。将10 IU/ml作为检测下限,具有95％可信区间。线性回归分析显示其斜率接近1.0 (R2=0.999)。批内变异值为3.88％～4.36％,批间变异值为8.5％～11.7％。20例健康献血者的阴性对照血清HBV-DNA检测均为阴性,而75例经COBAS Amplicor检测HBV DNA阳性患者的血清样本除1例阴性外,其余都为阳性。结论 LNA捕获TaqMan探针实时PCR方法为HBV-DNA检测的一种快捷灵敏、准确度高的新方法,值得临床实验室推广应用。
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肽核酸压电基因传感器阵列检测乙肝病毒的研究
随着声光技术、微电子技术的迅速发展,一种基于石英晶体的压电现象发展而来的石英谐振式基因传感器逐渐发展成熟起来,它是以压电石英晶体为换能器、以特异性短核酸探针为分子识别元件的一种新型基因传感器,在它诞生之初就因为集合了核酸探针杂交的高特异性和石英晶振微天平的高灵敏性可能成为新一代基因诊断技术.但是,目前研究报道的基因传感器表面固定的都是DNA探针,形成一些难以克服的困难.
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TaqMan MGB蛋白探针法检测IL28brs12979860位点基因多态性
目的 建立一种TaqMan real-time PCR探针杂交法,用于快速检测人rs12979860位点多态性.方法 从人各不同组织器官中提取基因组DNA,利用小沟结合蛋白(MGB)探针的高度特异性,设计相应的引物探针,根据实时荧光定量PCR过程中产生的信号在2个检测通道的强弱变化来鉴别等位基因差异.后所测样本经DNA测序验证结果的准确性.采用x2检验进行统计分析.结果 利用TaqMan MGB蛋白作为探针,能够区分只有1个碱基差异的目标基因组片段.该方法低检测浓度为1.5 ng/μl,扩增有效率达97.6％.不同组织器官(肾、心脏、子宫、血浆)及分泌物(鼻咽部)的DNA均可以用于检测.在随后对40例高加索人和50例黄种人的检测中亦证实,rs12979860位点的基因型及等位基因频率存在差异,高加索人以CT基因型为主(26/40),而黄种人以CC基因型为主(40/50),差异有统计学意义(x2=18.75,P＜0.05).在两种族人群中,抗病毒治疗血清学转换与患者基因型之间差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 TaqMan MGB法能快速并准确地区分rs12979860位点多态性,具有高度特异性和灵敏度,适用于多种样本的临床检测,是对丙肝患者抗病毒个体化治疗进行遗传分析的理想工具.
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单核苷酸多态性的碱基淬灭探针技术检测方法的建立
致性Kappa检验显示,4种碱基淬灭探针检测SNP方法与DNA测序技术的检测结果一致(Kappa=1;P=0.00).结论 碱基淬灭探针检测SNP技术简单、快速、准确,适用于大批量基因分型研究.
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染色体α卫星探针在染色体畸变诊断中的应用
目前临床确诊染色体畸变的主要方法是核型分析,但其检测周期长,诊断结果在一定程度上会受分析者经验影响.近年来,荧光原位杂交(FISH)技术利用非放射性同位素标记核酸探针对分裂间期和分裂期细胞作原位杂交,程序简单、诊断周期短且能识别染色体显带技术难以确认的一些畸变.我们采用人13、21号染色体α卫星探针直接在分裂间期和中期细胞上作FISH,分析13和21号染色体倍性,并着重探讨FISH技术在临床诊断中的应用价值.
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上转磷光技术在生物医学检测中的研究进展
上转磷光技术(UPT)是指用上转磷光颗粒作示踪物,通过在其表面标记抗体或核酸探针等,与样品中的蛋白质或核酸进行特异性结合,从而检测组织或细胞中靶分子的标记检测技术.
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含内质控的新型检测HIV-1感染的双特异性探针实时荧光RT-PCR方法的建立
目的 以包含内标RNA的病毒样颗粒作为内质控,建立一种新型的检测HIV-1感染的包含双特异探针实时荧光RT-PCR方法(Dual-specificity probe real-time reverse transcriptase-PCR,DSPrtRT-PCR),提高HIV-1RNA的检出率.方法 采用针对HIV-1基因组保守区域内两个不同区域的两条不同的荧光探针和两组引物,建立检测HIV-1RNA的实时荧光RT-PCR方法,并构建了内含HIV-1内标RNA的病毒样颗粒,将其作为本方法的内部假阴性质控,考察了所建立方法的检测灵敏度和特异性.比较了单探针和双探针检测方法在HIV-1亚型检测能力、检测灵敏度和临床样本的检测适用性.结果 所建立方法的灵敏度为125 U/ml;在检测HIV-1阴性样本时具有100%的特异性.和单探针方法比较,双特异探针方法在HIV-1亚型检测中能检测到M族的所有亚型以及O族;检测灵敏度和单探针方法比较无统计学意义;在对60份临床样本的检测中,单探针方法只能检出39份,而双探针方法能检出50份(10份检测阴性的样本用COBAS检测证明为阴性).结论 本研究建立的HIV-1 RNA的DSPrtRT-PCR具有很高的检测灵敏度以及HIV-1多亚型的检测能力.在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性.
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胃癌组织端粒酶hTRT与抑癌基因p53和p16表达的关系
目的:探讨胃癌中端粒酶基因hTRT及抑癌基因p53和p16 mR-NA表达与临床参数的关系,评价hTRT表达检测在胃癌诊断中的价值,探讨hTRT基因与p53和p16基因表达的关系.方法:用核酸探针和原位杂交的方法分别检测端粒酶基因hTRT及抑癌基因p53和p16 mRNA在57例胃癌、57例癌旁组织和69例胃良性病变中的表达和分布情况.结果:57例胃癌中hTBT基因表达阳性率为94.7%(54/57);57例癌旁组织中hTRT基因表达阳性率为0%(0/57);69例胃良性病变中hTBT基因表达阳性率为2.9%(2/69).胃癌组织中hTRT基因的表达与癌旁组织、胃良性病变比较差异有显著性(P均＜0.001).胃癌组织中hTRT的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移相关(P均＜0.05),与肿瘤分期无相关性(P＞0.05).p53仅在胃癌组织中表达,胃黏膜良性病变中未见表达.胃癌组与后者比较有显著差异(χ2=35.889,＜0.01).p16仅在胃癌组织中表达,胃黏膜良性病变中未见表达.胃癌组与后者比较有显著差异(χ2=34.059,＜0.01).统计学分析,胃癌中hTRT基因表达和p53基因表达无相关性(χ2=0.100,＞0.05).胃癌中hTRT基因表达和p16基因表达无相关性(χ2=0.065,＞0.05).结论:端粒酶基因hTRT表达检测在胃癌诊断中可能有一定的价值.研究结果还不能证明hTRT基因表达和抑癌基因p53、p16的表达有必然的联系.hTRT基因和抑癌基因p53、p16在胃癌发生中的相互作用和涉及的其他机制尚需深入研究.
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不同分子遗传学方法用于自然流产绒毛细胞遗传分析的效果
目的 探讨多重连接探针扩增法(MLPA)+荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)+FISH的分子遗传学方法用于自然流产绒毛细胞遗传分析的效果.方法 收集29例自然流产绒毛组织以及6例选择性终止早期妊娠妇女的绒毛组织,采用CGH+FISH、MLPA+FISH方法进行遗传学分析,并与传统的绒毛细胞培养染色体核型分析结果进行比较.结果 MLPA+FISH检测时间为40 h,CGH+FISH检测时问为120 h,绒毛细胞培养染色体核型分析时间为(240±72)h,3者分别比较,差异有统计学意义(P<0.01).CGH、MLPA、FISH和绒毛细胞培养染色体核型分析的标本成功获检率分别为97%(34/35)、100%(35/35)、100%(35/35)和91%(32/35),4者比较,差异无统计学意义(P>0.01).除去CGH获检失败的1份样本外,MLPA+FISH与CGH+FISH的分析结果一致,CGH获检失败的1例标本经MLPA+FISH检测获得了结果.CGH+FISH或MLPA+FISH检测结果与绒毛细胞培养染色体核型分析结果的不一致率分别为13%(4/31)、12%(4/32),两者比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 MLPA+FISH检测耗时短,检测成功率高;MLPA+FISH检测用于自然流产绒毛细胞遗传分析是对绒毛细胞培养染色体核型分析方法的重要补充.
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多重连接依赖探针扩增技术在稽留流产绒毛组织染色体核型分析中的应用
目的 探讨多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术在稽留流产绒毛组织染色体核型分析中的应用.方法 选择2008年2-10月于深圳市妇幼保健院就诊,经激素水平测定、B超和临床检查确诊为稽留流产患者91例为病例组;随机抽样方法选择同期20例经激素水平测定、B超和临床检查为正常妊娠,要求人工流产者为对照组.人工流产术中无菌条件下获取两组妇女的绒毛组织,培养后每份样本分别采用传统细胞遗传学G显带染色体核型分析方法、同时提取DNA采用MLPA技术分析染色体异常,并与传统染色体核型分析结果进行比较.结果 91例病例组样本中,有84例(92%)采用MLPA技术进行染色体核型分析的非整倍体结果与传统染色体核型分析方法的结果一致,其中包括正常核型40例、常染色体三体29例、常染色体双三体1例、X染色体单体合并常染色体三体1例、X染色体单体10例、嵌合性X染色体单体2例和1例结构异常46,XX,der(5)t(5;8)(p1.2;q1.2);其余结果不一致的7例中,采用传统染色体核型分析方法检测出2例三倍体和5例四倍体,而采用MLPA技术检测结果均为正常的二倍体.20例对照组样本两种技术的分析结果均一致.结论 MLPA技术分析染色体非整倍体异常是一种简单、快速且有效的方法,具有临床实际应用价值.
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不同扩增方法和探针长度对植入前单个卵裂球比较基因组杂交检测结果的影响
目的 探讨不同扩增方法和探针长度对植入前单个卵裂球比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)检测结果的影响,为植入前产前诊断奠定基础.方法 随机将20枚植入前6～8细胞期胚胎卵裂球分为A和B组(各10枚),取1名正常男性外周血20枚淋巴细胞,分为C和D组(各10枚)作为对照.A和C组经简并寡聚核苷酸聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction,DOP-PCR)、B和D组经多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)分别进行全基因组扩增(whole genome amplification,WGA),用上述全基因组扩增产物进行PCR扩增TBX1基因2号外显子,验证其特异性.将获得的WGA产物制备成250～750 bp和750～2000 bp 2种不同长度的探针与正常男性中期染色体核型进行杂交,Y染色体性别决定区(sex-determining region of Y,SRY)基因验证CGH检测结果.结果 (1)用DOP-PCR扩增时,A组10枚卵裂球中有9枚WGA成功,C组10枚淋巴细胞WGA均成功;但其扩增产物进一步扩增TBX1基因2号外显子时,出现较多非特异性条带.CGH检测中.5例卵裂球用长度250～750 bp的探针检测时,1例失败,1例CGH软件核型分析结果与SRY结果不一致.(2)经MDA的B和D组,均WGA成功;其产物进一步扩增TBX1基因2号外显子时,非特异性条带少.CGH检测中,探针长度为250～750 bp的5例卵裂球均检测成功,且与SRY验证结果一致.(3)用长度为750～2000 bp探针检测时,杂交效果不好.结论 单卵裂球全基因组扩增,MDA较DOP-PCR方法稳定,特异性强,CGH检测中,扩增产物酶切至250～750 bp制备的探针杂交图像均匀、清晰,软件分析核型结果稳定、准确.
