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新波时间分辨荧光仪原理及故障分析
时间分辨荧光仪是由苏州新波生物公司生产的,具有操作简单、性能稳定、快速准确等优点的仪器.现将仪器的测量原理及日常使用中的故障,分析如下.1测量原理通过应用三价稀土离子作为示踪物,标记蛋白质、多肽、激素等物质,待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤性反应等)发生后,用荧光分析仪测定后产物中的荧光强度,以此来判断反应体系中被测物质的浓度.
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急性髓系白血病细胞端粒酶活性与疗效关系的初步研究
我们采用端粒重复序列扩增法-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-银染法检测了正常组织和急性髓系白血病(AML)患者治疗前后骨髓细胞的端粒酶活性变化，以探讨其临床意义。对象和方法1 对象选择初发未治AML患者32例，按国内诊断标准［1］确诊，其中男22例，女10 例，年龄16～67岁, 中位年龄32.9岁。M01例，M14例，M212例（M2a10例，M 2b2例），M3a4例，M43例，M58例（M5a1例，M5b7例）。M3 患者用全反式维甲酸 40～60?mg/d治疗至完全缓解(CR)，获CR后用HA（高三尖杉酯碱+阿糖胞苷）方案治疗；其余患者用DA（柔红霉素+阿糖胞苷）或HA方案诱导，缓解后用AA（阿克拉霉素+阿糖胞苷）+足叶乙甙方案。经1～2个疗程后该组患者获骨髓缓解 20例。非血液病患者(包括肝炎、系统性红斑狼疮)及正常志愿者9名作为对照。2 试剂端粒酶PCR-ELISA试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司，阳性对照为人胚肾 293细胞株(试剂盒提供)，阴性对照为端粒酶提取物加1?μg/μl RNase A，37?℃孵育 20 min。3 端粒酶活性检测3.1 标本留取:初发未治患者在初诊时、骨髓缓解患者在化疗后第14天各取骨髓2～3?ml，肝素抗凝，Ficoll分离单个核细胞，初治组白血病细胞含量大于0.70，锥虫蓝染色拒染率大于95 %，PBS洗涤2次，保存于-70?℃待用。正常组织（膀胱、胃、肺组织）30份，均由本院外科提供，标本均取于离体后1?h内，液氮速冻后保存于-70?℃待用。3.2 端粒酶提取物提取：每份实体组织取标本量100?mg，用液氮速冻后在研钵中研成粉末，转至洁净管中，加入200?μl裂解液；每份单个核细胞直接加入200?μl裂解液。充分混匀， ?4℃裂解30?min，16?000×g离心10?min，小心地将上清(约150?μl )移至另一洁净管中，-70?℃保存备用或即用。紫外吸收法测定蛋白质含量。3.3 TRAP-PCR-ELISA：取上述提取液5～20?μl (蛋白质含量10?μg)加入25?μl TRAP-PC R扩增液，用无菌DEPC水补充至50?μl，加40?μl石蜡油覆盖，在PCR仪上扩增：25?℃延伸30?min；94?℃灭活5?min；扩增反应：94?℃ 30?s，50?℃ 30?s，72?℃ 90?s ，循环30次；72?℃延伸10?min。取上述PCR产物5?μl加变性液20?μl混匀，置室温10 ?min，加入225?μl杂交液(含地高辛标记的探针)，混匀后取出100?μl包被于抗生物素的酶标板中,20?℃作用2?h，加入过氧化物酶并与TMB底物显色30?min，在时间分辨荧光仪（WALLAC公司）测定波长为450?nm和690?nm A值,差值△A(A450-A6 90)代表细胞端粒酶活性。3.4 PAGE-银染：取PCR产物45?μl，加氯仿∶异戊醇(24∶1)60?μl混匀，5?000?r/min离心5?min后将上清液小心移至另一0.5?ml洁净管中，加3?mol/L醋酸钠5?μl和无水乙醇3 00?μl，混匀置-20?℃冰箱过夜，再离心，吸掉无水乙醇，在室温下风干，加5～10?μl 去离子水溶解，加上样缓冲液，经120?g/L非变性PAGE，凝胶用体积分数为10%的乙醇固定5 ?min，体积分数为1%的硝酸浸胶5?min，在染色液中染色10?min，用显色液洗2次，醋酸终止反应，制膜干燥保存。用凝胶成像分析仪摄影。4 统计学处理采用SPSS 9.0统计软件包进行t检验。
