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  • 黄芩苷抗丙型肝炎病毒的活性研究

    作者:李健蕊;陈金花;李虎;董飚;马雪梅;彭宗根

    目的 研究黄芩苷抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性.方法 在体外无细胞系统中应用荧光共振能量转移法检测黄芩苷对HCV NS3/4A蛋白酶和NS3解旋酶的抑制活性;在Huh7.5细胞培养内分析其对野生型及临床常见耐药型HCV感染的抑制作用,并考察与目前临床应用的抗病毒药物联合抗HCV的活性.结果 黄芩苷具有抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性,但对NS3解旋酶无抑制作用.细胞培养内抗HCV活性测定显示,黄芩苷抑制野生型HCV复制的半数抑制浓度(EC50)为(31.306±9.559)μmol/L,抑制蛋白酶抑制剂常见耐药突变A156T和D168V突变HCV复制的EC50分别为(53.175±19.141)μmol/L和(66.722±30.994)μmol/L,抑制多聚酶抑制剂常见耐药突变S282T突变HCV复制的EC50为(63.673±19.770)μmol/L.黄芩苷与多聚酶抑制剂索非布韦联用还具有协同抗病毒效果,但与具有相同作用机制的西咪匹韦联用有拮抗作用.结论 黄芩苷具有抗HCV作用,其机制为抑制HCV蛋白酶,对蛋白酶抑制剂常见耐药突变病毒有效,与多聚酶抑制剂联用有协同抗病毒作用.

  • HCV非结构蛋白NS5A基因的斑马鱼肝脏表达模型

    作者:赵晔;胡占英;佟军威;赵立勋;蒋建东;张靖溥

    目的 建立HCV非结构蛋白NS5A基因在斑马鱼肝脏特异表达的模型,研究HCV NS5A的体内作用机制并初步探讨HCV NS5A对肝病理标志基因表达的影响.方法 克隆肝基因表达调控序列——斑马鱼脂肪酸结合蛋白基因增强子序列(eFABP)和HCV非结构蛋白基因NS5A序列,利用CMV启动子序列,构建HCV NS5A基因和报告基因绿色荧光蛋白基因eGFP在肝脏共表达的基因构件pFC-5AiR.经细胞转染实验验证所建构件的报告基因DsRed表达红色荧光蛋白后,将该基因构件线性化并经显微注射导入斑马鱼胚胎;通过荧光显微镜观察和整体原位杂交技术对目的基因NSSA的表达进行定位,验证其肝脏特异性表达.采用RT-PCR方法和western blot方法对HCV NS5A基因的转录和翻译水平进行检测;并检测肝脏病理相关的标志基因的转录水平变化.结果 细胞转染实验证明基因构件pFC-5AiR的报告基因DsRed能够在肝癌细胞Huh7中表达;斑马鱼胚胎注射该基因构件后在肝脏能够观察到红色荧光蛋白基因DsRed的表达;RT-PCR和western blot结果显示HCV基因NS5A能够在斑马鱼体内正确表达;原位杂交结果进一步证明了NS5A的表达集中在斑马鱼肝脏内.进一步RT-PCR检测表明HCV NS5A在斑马鱼体内的表达可导致一些肝代谢和纤维化相关基因的上调,如Adiponectin、LDLR、Argsyn、TGF-β和HMGR等,推测NS5A在肝脏脂肪病变和纤维化中具有一定作用.结论 成功建立了斑马鱼肝脏表达HCV NS5A的模型;初步数据表明HCV NS5A在斑马鱼体内的表达与部分肝代谢和纤维化标志基因的异常表达相关;该模型可以用于HCV NS5A的体内病理机制的研究.

  • HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清病毒载量与肝组织学改变的关系

    作者:陆传统;周文红;胡爱荣

    目的 探讨HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织损害的关系.方法 以HBeAg阳性慢性乙型肝炎病例为对照,回顾分析HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA水平与肝组织病理炎症分级、纤维化分期之间的关系.结果 HBeAg阴性与阳性组HBV DNA 平均含量分别为(5.38±1.27)log10拷贝/ml和(6.80±1.18)log10拷贝/ml,差异有统计学意义(P<0.01).与HBeAg阳性组比较,HBeAg阴性组肝组织炎症分级及纤维化分期较高(P<0.01).HBeAg 阴性患者HBV DNA水平与肝组织炎症分级及纤维化分期呈正相关(P<0.01).结论 HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒载量低,乙肝病毒载量与肝损害呈正相关.

  • 云南省大理地区丙型肝炎病毒E1/E2基因序列分析

    作者:王佳丽;王静林;杨红樱;钟国梁;马顺高

    目的 了解云南省大理地区HCV基因分型及主要流行基因型6n和3a HCV E基因遗传进化和分子特征.方法 2014年1-5月在大理州人民医院收集临床诊断丙型肝炎患者血清;HCVRNA提取,RT-PCR扩增和序列分析.结果 收集到HCV患者血清24份,21份HCV 5UTR基因扩增阳性,其中HCV基因3型15例(3a4例,3b 11例)和HCV基因6型6例(6k 4例,6n 2例).2株HCV(10和4)E1/E2基因序列分析结果显示:4与3a型HCV同源性高,87.98%±3.07和87.97%±2.82,10病毒与6n型HCV同源性高,90.30±1.87和90.54±1.53;2株病毒E1/E2基因均存在10个潜在糖基化位点;与其他病毒相比,2株病毒仅有5个T细胞抗原表位预测分值发生变化,其余37个抗原表位预测分值变化不大.结论 大理地区目前以基因3型(3a、3b)和基因6型(6k、6n)为主要流行HCV基因型或基因亚型,大理地区流行的3a和6n型HCV的致病性、免疫学等生物学特性未发生明显变化.

  • 霉酚酸对丙型肝炎病毒复制的抑制作用

    作者:陈晖;叶力;苏锦明;李彧;曾锦荣;霍文哲

    目的 调查临床使用的免疫抑制剂,包括霉酚酸、雷帕霉素和他克莫司(FK-506)对肝细胞中HCV复制的影响.方法 用各种免疫抑制剂处理HCV JFH-1感染的肝细胞,利用实时定量RT PCR检测HCV RNA的水平,用Western Blot检测HCV核心蛋白表达水平.结果 用霉酚酸处理HCV JFH-1感染的肝细胞,可以极大地降低HCV RNA的水平和减少HCV核心蛋白的表达;雷帕霉素和FK-506对HCV复制的影响不大.外源性鸟嘌呤核苷可以逆转霉酚酸对HCV复制的抑制作用.结论 在肝细胞中霉酚酸通过耗尽细胞的鸟嘌呤核苷抑制HCV复制.霉酚酸在临床上可能有益于HCV感染的肝移植患者.

  • 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

    作者:刘妍;成军;白桂芹;严福明;吴顺华;王琳;张玲霞

    目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCV NS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析.结果成功克隆出HCV NS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程.结论成功克隆出HCV NS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索.

  • 我国六省市(区)部分人群丙型肝炎病毒感染调查

    作者:鲁健;蒋郁青;赵洪兰;江永珍;田瑞光;张勇;王笑怡;毕胜利

    目的 了解我国健康人群丙型肝炎病毒感染现状.方法 采用北京万泰生物药业的HCV EIA诊断试剂检测人群血清丙型肝炎病毒(丙肝,HCV)IgG抗体.结果 六省市(区)人群血清共9 538份,HCV抗体阳性数37份,总阳性率为0.39%,其中北京人群阳性率0.23%,黑龙江人群为0.74%,山东人群为0.26%,宁夏人群为0.10%,甘肃和四川人群阳性率均为0.44%.对37例HCV阳性者性别及年龄分析,男性19例占51.35%,女性18例占48.65%,<10岁年龄组1例,占2.70%,10~19岁组5例,占13.51%,20~29岁4例占10.81%,30~39岁组6例,占16.22%,40~49岁组9例,占24.32%,≥50岁有12例占32.43%.对HCV阳性者重叠其他型别肝炎病毒感染分析,单独HCV阳性2例,占5.41%,伴有HAV-IgG抗体阳性35例,占94.59%,伴有HEV-IgG抗体阳性10例,占27.03%,伴有HBsAg、HBcAb和HbeAb阳性者2例,占5.41%,该2例HAV和HEV抗体也阳性.结论 六省市(区)人群HCV感染率均在1%以下,感染者年龄以50岁以上高,决大多数HCV阳性者重叠有其他型别的肝炎病毒感染.

  • 山东烟台地区HCV感染的基因分型研究

    作者:张国英;浦声波;于学英;杨建;石建凤;许爱玲;郭振华;乔明刚;张杰;荆永正

    目的 了解山东烟台地区丙型肝炎病毒的基因分型,结合受试者的肝功能指标观察基因型别与肝损情况是否相关.方法 采用特异性PCR引物对HCV RNA5'UTR区和(或)NS5B区进行扩增,PCR产物进行序列分析,通过与GenBank中参考序列的比对,联合遗传进化树对标本予以分型.结果 9例无偿献血员中检出1b和3a两种基因亚型,分别为8例和1例.33例丙肝患者中,检出1b、2a和6a三种基因亚型,分别为22(66.7%)、10(30.3%)和1(3.03%)例.1b亚型是烟台地区HCV携带者的优势流行基因亚型,在不同人群中分布差异无统计学意义(x2=0.796,P=0.373);不同基因分型的受试者其肝损指标的差异有统计学意义(P<0.05),2a型携带者的ALT、AST均值明显高于1b型.结论 山东烟台地区HCV基因型呈现多样性,以1b为主,并首次检出3a和6a亚型.HCV基因型与肝损指标具有相关性,2a型HCV感染可能在肝细胞的病变过程中起着重要作用.

  • 广州地区HBV/HCV重叠感染患者流行及临床特征研究

    作者:施海燕;许敏;廖宝林;梁惠颖;熊红品;陈冉;伍燕文

    目的 探讨广州地区乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)重叠感染患者的流行及临床特征,为提高其诊治提供依据.方法 回顾2005年4月至2011年10月我院收治慢性HBV感染患者临床资料,分析HBV/HCV重叠感染患者流行特征,按照HBeAg状态以及HBV DNA、HCV RNA水平分组分析HBV/HCV重叠感染患者临床特征.结果 HBV/HCV重叠感染率为1.9%(128/6604),主要见于伴静脉吸毒史的男性中年患者.HBeAg阳性与阴性重叠感染患者之间的生化指标和终末期肝病发生率均无差异.HBeAg阳性患者HBV DNA阳性率高于阴性患者(P <0.001),而HCV RNA水平阳性率低于阴性患者(P =0.007).HBV DNA阳性患者终末期肝病发生率较阴性组升高(58.1%比37.9%,P=0.027),而HCV RNA阳性与阴性患者之间发生率相似(43.6%比49.2%,P=0.540).结论 广州地区HBV/HCV重叠感染率较低,HBV DNA水平可能与患者的疾病进展相关.

  • 67例慢性丙型肝炎治疗过程及随访中血清ALT、病毒载量及肝纤维化指标的变化

    作者:方玉才;王秋英;潘统桧;杨燕飞;高晓磊

    目的 观察聚乙二醇干扰素α-2b联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎过程中肝功能、病毒复制及肝纤维化指标的改变情况.方法 检测67例慢性丙型肝炎患者在干扰素联合利巴韦林治疗开始(0周)、结束(48周)和停药12周(60周)时血清丙氨酸转氨酶(ALT)、丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)和层粘连蛋白(LN)水平.结果 治疗后完全应答组(CR-S,43/67) ALT、HCV RNA及血清4项纤维化指标均显著下降(P <0.05或P<0.01),部分应答组(CR-R,13/67)和无应答组(NR,11/67) ALT、HCV RNA及血清4项纤维化指标变化不明显,反跳甚至更高.结论 聚乙二醇干扰素α-2b联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎约65%患者完全应答,随着肝细胞炎症的改善,病毒RNA滴度、肝纤维化指标水平明显下降,表明干扰素联合利巴韦林能抑制HCV RNA复制,调节机体免疫功能,减轻肝脏炎症反应,改善肝功能,减少肝纤维化.

  • HCV免疫学诊断抗原与链亲和素融合蛋白的制备及应用研究

    作者:张庭瑛;鲁健;赵敏;赵国霞;邓瑶;毕胜利;高基民;谭文杰

    目的 制备带有链亲和素(SA)标签的丙型肝炎病毒(HCV)融合蛋白,并初步探讨其在抗-HCV ELISA检测中的应用.方法 构建了HCV诊断抗原与链亲和素融合蛋白重组表达质粒pET-11d-C44P-SA,在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,并用Western Blot进行鉴定,表达的融合蛋白经镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性后分别包被生物素化以及普通酶联板,进行人血清抗-HCV检测.结果 成功构建了带有SA标签的重组表达质粒,其在大肠埃希菌BL21(DE3)中实现高效表达,制备的融合蛋白纯度可达90%以上.建立ELISA法进行人血清抗-HCV检测显示:融合蛋白包被生物素化酶联板检测灵敏度与特异性明显高于普通酶联板.结论 构建的融合蛋白作为包被抗原,结合利用SA标签与生物素化酶联板,明显提高了抗-HCV检出的灵敏度与特异性,该策略为进一步提高抗-HCV检测试剂的质量打下了基础.

  • 1b型丙型肝炎病毒NS3-4b重组腺相关病毒载体的构建及表达

    作者:陈甜;孙海霞;泰卫兵;朱凤琴;李雪玲;曹红;徐启桓;李刚

    目的 构建1b型丙型肝炎病毒(HCV) NS34b基因重组腺相关病毒载体并了解其在HEK 293细胞中的表达,为进一步研究HCV重组腺相关病毒疫苗及其树突状细胞疫苗奠定前期基础.方法 收集基因1b型的丙型肝炎病人血清,用RT-PCR的方法扩增NS3-4b全长片段,与腺相关病毒的表达载体pAAV.CMV.eGFP重组,构建pAAV.CMV.HCV.NS3-4b重组表达载体,转染HEK293细胞,检测其蛋白表达情况.结果 PCR扩增获得的NS3-4b条带与预期大小(2838 bp)一致,重组质粒经双酶切和测序证实NS3-4b基因已重组成功,重组质粒转染HEK 293细胞后Western Blot图可见有目的蛋白表达.结论 成功构建腺相关病毒重组HCV NS3-4b载体并且其能在真核细胞中表达.

  • 采用TaqMan MGB探针定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70变异

    作者:胡中杰;刘颖;仇丽霞;范作鹏;聂巍;梁珊

    目的 建立一种定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70位点主要野生株(Arg-CGG,70w)和变异株(GIn-CAG,70M)的方法.方法 设计一对分别针对70 W和70 M的TaqMan MGB探针,建立一种实时逆转录聚合酶链反应定量检测方法.验证方法的敏感性、特异性和准确性.结果 所设计的引物和探针具有良好的特异性,敏感性可达5拷贝/反应.进一步的克隆测序证实了新方法的可靠性.结论 建立了一套HCV 1b亚型C区氨基酸70变异的定量检测系统,具有较高的敏感性、特异性和准确性,为研究70 W和70 M在抗病毒治疗中的动态变化提供了技术手段.

  • 基于辛德毕斯病毒载体的重组丙肝病毒颗粒的制备与鉴定

    作者:付娟娟;朱武洋;李江姣;王焕琴;谭文杰;殷建忠;梁国栋

    目的 利用自主研发的辛德毕斯病毒载体构建含有丙型肝炎病毒( HCV)结构蛋白E1E2的重组病毒颗粒.方法 将编码HCV包膜糖蛋白的E1 E2基因克隆至辛德毕斯病毒载体,构建重组质粒pBR-XJE1E2和pVA-XJE1E2,转染BHK-21细胞后获得重组丙肝病毒颗粒.并通过RTPCR、间接免疫荧光和Western Blot方法鉴定表达E1E2蛋白的重组病毒颗粒.结果 酶切、PCR和测序分析表明重组质粒构建成功.RT-PCR、间接免疫荧光和Western-Blot鉴定结果表明重组质粒转染细胞后能包装出表达E1E2的丙肝病毒颗粒.结论 以辛德毕斯病毒载体为基础构建的重组质粒可在真核细胞中包装出重组丙肝病毒颗粒,这为进一步研究其在动物体内免疫反应奠定了基础.

  • 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4及其基因多态性在丙型病毒性肝炎中的研究进展

    作者:李邦涛;肖丽

    细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是淋巴细胞表面的一种与免疫信号传递有关的免疫球蛋白,与B7结合后能负调节活化的T淋巴细胞的功能,抗CTLA-4单克隆抗体能阻止这种负调节作用, CTLA-4基因多态性可影响CTLA-4的功能,对于不同个体免疫强度的差异起到关键作用。丙型肝炎病毒感染的自然清除及慢性化与感染者体内的CD4+及CD8+T淋巴细胞的免疫应答有密切关系,肝组织和外周血中HCV特异性CD8+T淋巴细胞的活性在决定慢性丙型肝炎干扰素治疗效果中起到十分重要的作用。所以,本文旨在综述CTLA-4及其基因多态性与丙型肝炎病毒感染的相关性。

  • 丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨荧光免疫分析法的建立

    作者:谭玉华;孙勇;吴道贫;陈建起

    目的建立丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨荧光免疫分析法。方法采用丙型肝炎病毒基因重组多表位嵌合蛋白作为包被抗原,生物素标记抗原作为桥接抗原,链霉亲和素标记铕作为示踪物,配制以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,自建方法的校准品以国家标准血清物质GBW ( E )090047为溯源,应用桥式双抗原夹心法建立丙型肝炎病毒抗体时间分辨荧光免疫分析法。结果自建方法在0.031~4.00 NCU/ml内,相关系数可达0.99;分析内和分析间变异系数均小于10%;灵敏度可达0.016 NCU/ml;校准品的效价比在0.90~1.10,平均回收率为101.47%;与相关疾病的抗原或抗体无明显交叉反应,其表观浓度值均小于0.03 NCU/ml;参考值为0.05 NCU/ml;符合国家检定标准的要求;37℃恒温箱烘烤7d后检测性能无明显改变;与同类方法学比对符合性好。结论自建方法精密度好,灵敏度高,特异性强,准确性好,线性范围宽,符合率高,能满足临床检测需要。

  • 抗-HCV 联合 TMA 定性检测 HCV-RNA 在维持性血液透析患者丙型肝炎病毒感染早期诊断中意义的探讨

    作者:黎嘉敏;何永成;曾劲峰;卢亮;李彤

    目的研究维持性血液透析患者丙型肝炎病毒( HCV)感染的血清学诊断方法,探讨抗-HCV联合HCV-RNA检测在维持性血液透析患者HCV感染早期诊断中的意义,以期获得维持性血液透析患者HCV感染早期诊断的可靠方法。方法选择深圳市第二人民医院血液透析中心183例维持性血液透析患者为研究对象,分别使用国产和进口HCV抗体试剂盒检测抗-HCV,使用TMA法定性检测HCV-RNA,荧光定量PCR法定量检测HCV-RNA,比较不同产品及诊断方法对HCV的检出率,评价ALT变化与HCV-RNA载量的关系,评价抗-HCV S/CO值与HCV-RNA载量的关系。结果国产和进口试剂检测抗-HCV的检出率均为7.1%( P=1.000);TMA法定性检测HCV-RNA的检出率为8.7%,免疫荧光定量PCR法的检出率为5.5%,但两者之间差异有统计学意义(χ2=87.537,P=0.000);HCV-RNA定性检测比检测抗-HCV的检出率高,两者的差异有统计学意义(χ2=81.531,P=0.000);联合抗-HCV和HCV-RNA定性检测结果HCV阳性共19例,检出率为10.4%,与单独检测抗-HCV比较差异有统计学意义( P=0.031),但与单独定性检测HCV-RNA比较差异无统计学意义(P=0.250)。 HCV-RNA的载量和ALT的变化无相关性(r=0.189,P=0.536);抗-HCV初筛的S/CO值与HCV-RNA载量无相关性( r=0.174, P=0.569)。结论 HCV-RNA定性检测较抗-HCV检测能缩短维持性血液透析患者HCV感染检出的窗口期,有利于早期诊断。 HCV-RNA定性检测能较临床现行的HCV-RNA免疫荧光定量检测显著提高HCV感染的检出率。联合抗-HCV和TMA法定性检测HCV-RNA既能缩短HCV感染的“窗口期”,也能显著提高HCV感染的检出率,可避免漏检处于血清转换期或慢性病毒携带或既往感染的“隐性”患者,值得临床推广应用。 ALT的变化和HCV载量无明显相关性,在血液透析患者中辅助早期诊断HCV感染的作用较小。

  • 慢性丙型肝炎患者自身抗体检测的临床意义

    作者:龚希平;周镇先;黄菁;黄玲

    目的 探讨慢性丙型肝炎患者自身抗体检测的临床意义.方法 应用免疫荧光法(IIF)检测230例慢性丙型肝炎患者血清中自身抗体,并研究自身抗体与HCV RNA、肝硬化发生率、年龄、性别以及和ALT的关系.结果 230例慢性丙型肝炎患者中有95例至少有1项自身抗体阳性,总阳性率为41.5%,明显高于健康对照组2.5%,两组比较P<0.01,差异有统计学意义.HCV RNA阳性组与HCV RN阴性组自身抗体的检出率差异显著(P<0.05).自身抗体阳性组中丙型肝炎肝硬化发生率(65/95,68.4%)明显高于自身抗体阴性组(46/125,36.8%).而且年龄≥40岁以上的患者发生肝硬化率更高,两组间比较,P<0.05,差异有统计学意义.结论 慢性丙型肝炎患者中较为普遍存在自身免疫现象,且自身抗体的检出率与患者的年龄和肝硬化发生率明显相关,在丙型肝炎的常规诊疗中应加强检测自身抗体,对于慢性丙型肝炎患者的治疗具有较强的指导意义.

  • 人胰腺细胞cDNA 文库中丙型肝炎病毒NS4B 结合蛋白基因的筛选

    作者:温少芳;张锦前;孙荣华;李卓;高萍;王琦;刘顺爱;成军

    目的 从人胰腺细胞cDNA 文库中,采用酵母双杂交方法 筛选HCV NS4B 包膜蛋白的相互作用蛋白.方法 人胰腺细胞cDNA 文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA 文库质粒转化入酵母菌株Y187.构建pGBKT7-NS4B 作为诱饵质粒,随之转化酵母菌株AH109,用色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109 与Y187,用四缺培养基及X-α-gal 筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果 使用PUBMED 进行序列比对.结果 成功构建pGBKT7-HCV NS4B 重组质粒,并从人胰腺cDNA 文库中筛选出7 种与HCV NS4B 蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5RAP3、辅脂肪酶、胰石蛋白、凝乳蛋白、弹性蛋白酶2A、糜蛋白酶和胆盐刺激酯酶.结论 HCV NS4B 蛋白可能通过与所筛选出前述蛋白中参与代谢过程的相关蛋白结合,影响糖、脂类代谢过程.

  • 丙型肝炎病毒非结构蛋白3的体外表达与纯化

    作者:金博;李楠;吴凯;张林;王艳梅;翟俊山;朱超慧;宋久刚

    目的 构建丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)表达质粒并在大肠杆菌中表达其全长蛋白.方法 克隆HCV NS3的核酸序列3420-5312位点,插入pQE-11质粒的Bam H1限制性酶切位点,将此重组质粒转入大肠杆菌表达,用Western blot方法筛选阳性克隆,将含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统以提高HCV NS3蛋白的表达量.收集培养扩增的大肠杆菌菌体,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重组蛋白的不溶性包涵体,将包涵体充分洗涤后,溶于含10 mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中.释放的可溶性蛋白用SDS-PAGE电泳分离、洗脱,用离心过滤方法浓缩,乙醇沉淀,重复洗涤去除内毒素.结果 用此方法克隆的HCV NS3全长基因片段表达的重组蛋白分子量为69 kD.含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统后,HCV NS3蛋白的产出率可提高10倍以上.此方法生产的NS3纯化蛋白质产量,每升培养物为40 mg.内毒素含量低于20 EU/mg NS3蛋白.结论 HCV NS3与HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切关系,是HCV的抗病毒治疗和疫苗研究的重要靶点,全长HCV NS3蛋白的体外合成为HCV研究提供了一个有用的工具.

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