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核定位信号在JC病毒样颗粒入核转运中的作用
目的 探讨JC病毒(JCV)主要外壳蛋白VP1所含核定位信号(NLS)在JCV病毒样颗粒(VLP)入核转运中的作用.方法 应用位点诱变法将JCV野生型VP1(wtVP1)氨基末端3个氨基酸:第5位赖氨酸、第6位精氨酸、第7位赖氨酸分别置换为丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸,制备成NLS变异的VP1(△NLS-VP1).编码△NIS-VP1的基因克隆到原核表达质粒pET-15b中,体外表达、重组VP1 NLS变异的病毒样颗粒(△NLS-VLP),异硫氰基荧光素(FITC)标记后感染地高辛渗透或未渗透的SVG细胞,荧光显微镜观察VLP入核转运.结果 wtVP1组成的病毒样颗粒(wtVLP)可以进入地高辛渗透或未渗透的SVG细胞核,而△NLS-VLP只能进入细胞浆,不能进入细胞核;体外转染后,wtVP1主要在SVG细胞核表达,而△NLS-VP1主要在细胞浆表达;包裹外源性DNA的VLP感染SVG细胞后,则wtVLP包裹的DNA在细胞浆和细胞核内均可检测到,而△NLS-VLP包裹的DNA只能在细胞浆检测到,不能在细胞核内检测到.VLP体外结合分析发现,wtVLP与胞浆转运因子(importin)α、β均可结合,而△NLS-VLP与importin α、β均不能结合.结论 VP1 NLS对于VLP入核转运是必需的,VLP的入核转运是由VP1 NLS与importin相互作用介导的.
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JC病毒样颗粒可直接转运进入细胞核
目的探讨JC病毒(JCV)病毒样颗粒(VLP)是否可以直接转运进入细胞核. 方法应用JCV主要外壳蛋白VP1体外表达、重组VLP,在其表面标记异硫氰基荧光素(FITC),同时在其内部包裹荧光染料Cy3,感染培养的HeLa细胞和SVG细胞,荧光显微镜观察VLP入核转运. 结果 HeLa和SVG细胞感染包裹Cy3的FITC-VLP时,FITC与Cy3同时出现于细胞核内相同部位;而感染FITC-VP1与Cy3混合物时,FITC虽可在细胞核内检测到,但Cy3信号几乎消失.包裹Cy3的VLP用SDS-PAGE展开,荧光显像后行考马斯亮蓝(CBB)染色,发现Cy3和VLP移行至不同部位,证明Cy3不能与VP1结合,提示VLP以完整的颗粒形式转运进入细胞核.应用包裹外源性DNA的VLP感染培养的HeLa和SVG细胞,发现包裹的DNA在细胞浆和细胞核内均可检测到,提示JCV入核过程与VLP相同. 结论 VLP可以不经裂解直接转运进入细胞核,JCV入核转运可能与VLP相同.
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核定位信号结构特点及工作原理
核内的功能蛋白包括转录因子、剪接因子和其他的核蛋白,它们在胞浆中合成,通过本身的核定位信号与入核转运受体结合形成复合物,然后通过细胞核膜上的核孔复合体进入核内发挥它们的生物学功能.而要研究这些核蛋白的入核机制,可能会有许多问题萦绕脑中,例如:什么是核定位信号?它的结构特点是什么?它的工作原理是什么?通过什么样的方式才能预测核定位信号?入核转运的结构基础是什么?入核转运的影响因素有哪些?本篇综述通过核定位信号的结构和特点、影响核定位信号依赖的蛋白质入核转运的因素、入核转运的工作原理、入核转运的结构基础等几方面内容, 目的是使那些准备研究蛋白质入核机制,但是对核定位信号及其相关研究都不熟悉的研究者对核定位信号及其工作原理有个初步的认识,为将来的实验设计打下一个良好的基础.
