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细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导
目的 研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力.方法 用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500 μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察.结果 2 h后PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光.结论 细胞穿透肽PEP-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用PEP-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据.
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基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造
目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并入核实现细胞水平的基因敲除.方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-SBP-Tat-EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS-Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21 (DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Western blot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果.结果:经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低.结论:利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除.
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Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究
目的：采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获取可溶性 His-Tat-Vp3融合蛋白,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法：构建重组质粒 pFastBacTM1-TAT-VP3,转化DH10Bac 感受态细胞,获得杆状病毒质粒,转染 Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒,纯化并扩增该病毒。用适滴度的病毒刺激 Sf9细胞以诱导 His-Tat-Vp3蛋白表达,经 SDS-PAGE和 Western bolt鉴定,获得分子质量约21 kDa 的融合蛋白。采用 MTT 实验与流式细胞技术检测500、1000、2000 nmol/L的融合蛋白抑制肿瘤细胞(HeLa细胞)增殖及促凋亡的活性。结果：通过昆虫表达系统成功表达及纯化出Tat-Vp3融合蛋白,其中1000、2000 nmol/L融合蛋白组可显著抑制肿瘤细胞的增殖,并提高细胞的凋亡率。结论：成功构建 His-TAT-VP3融合蛋白昆虫系统表达载体,在昆虫表达系统中可诱导性可溶性高表达,所获融合蛋白能显著抑制 H eLa细胞的增殖,并促进其凋亡。
关键词： 细胞穿透肽 民凋亡素 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 增殖率 凋亡 -
人宫颈癌Hela细胞穿透肽的噬菌体展示技术筛选
目的 细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段.该肽段以其转导效率高,速度快,生物活性好,对细胞损害小等特点,成为药物导向治疗方法 研究领域的热点.本研究目的 在于利用噬菌体展示技术高通量、系统地筛选人宫颈癌Hela细胞的穿透多肽.方法 以Hela细胞作为对象,利用噬菌体随机肽库,采用细胞筛选的方法 ,筛选具有细胞膜穿透作用的多肽.将筛选得到的穿透多肽与增强型绿色荧光(EGFP)融合表达,通过荧光显微观察技术快速对多肽的穿透功能进行验证.结果 通过4轮的噬菌体文库筛选,目的 多肽得到了有效而快速地富集.初步的测序和验证得到了3条具有明显介导融合蛋白内化的短肽序列.结论 成功建立起基于噬菌体随机肽库的细胞穿透肽筛选技术,为肿瘤导向药物载体的研究开发奠定了基础.
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细胞穿透肽介导外源物质入胞转运研究进度
细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPP)是一类能够携带外源物质进入细胞的多肽,因其结构和功能的独特性和实用性,近20年里在生物医学领域得到了长足的发展.目前CPP向体内和体外输送物质的方法逐渐成熟.在基础研究领域,已成为研究细胞内分子相互作用的有用工具;在应用方面,CPP药物已进入临床前、临床Ⅰ和Ⅱ期试验,在肿瘤、中枢神经系统疾病和心血管疾病的治疗中显示出明显优势.本文对CPP的发展历程、分类、入胞机制和应用等做一综述.
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细胞穿透肽在生物医学领域中的应用
细胞膜作为活细胞选择性渗透屏障是细胞存活和功能的必要组成部分.然而,在许多情况下,外源性活性物质通过胞浆膜的有效传递存在物质运输至胞内的主要屏障.在过去20年里,多肽转运药物至细胞的潜能被许多细胞穿透肽的发现而重视.细胞穿透肽作为载体可以有效转运如小干扰RNA、核酸、蛋白质、小分子治疗物质、荧光量子点和磁共振成像造影剂等物质.本文主要介绍了细胞穿透肽的分类和细胞摄取机制,及其作为新型载体在细胞成像、核定位、pH-敏感和热靶向传递系统发展中的应用前景.
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基于酶敏感机制的可激活细胞穿透肽在靶向输送系统中的应用
细胞穿透肽的细胞膜穿透作用借助于一种非选择性和受体非依赖性的方式.该特点使得细胞穿透肽介导的细胞摄取过程适用于较广泛的细胞类型,而这种普遍性对于癌症治疗和诊断领域的应用无疑是重大障碍.因此,将体循环给药的细胞穿透肽惰化形式在肿瘤等病变区域选择性地转变为活化态成为研究热点.本文重点关注引入酶敏感机制的可激活细胞穿膜肽及其靶向递送系统,对此类传递载体的研究概况进行综述.
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细胞穿透肽的研究进展
细胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPP)是一类能够通过生物膜进入细胞的短肽,它具有一些其他运载系统无法比拟的优点:低浓度条件下,可以穿过细胞膜进入细胞并且不会对膜造成明显破坏和损伤;能介导各种物质包括小分子、核酸、蛋白多肽以及纳米粒子等入胞;高效、低毒.本文就CPP的分类、与载物的连接方式、穿膜机制、应用和常用研究方法等方面进行系统的综述,并对CPP的临床应用前景进行展望.
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特洛伊肽运载核酸的研究进展
特洛伊肽(trojan peptides),又称细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPP)或蛋白转导域(protein transduction domains,PTD),是一类少于30个氨基酸的小肽片段,它们一般含有多个碱性氨基酸,能够高效跨越细胞膜并将多种不同类型的大分子物质(如多肽,蛋白质,核酸等)运送至细胞内.本综述主要阐述了利用特洛伊肽将质粒DNA和siRNA运送至培养的哺乳动物细胞以及动物体内的研究进展,并阐明了这一运载系统在基因功能研究和临床应用上的巨大潜力和意义.
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细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞
目的 研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力.方法 用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性.结果 EGFP蛋白不能进入细胞内.PEP-1-EGFP融合蛋白可在5 min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27 h仍可观察到微量绿色荧光.PEP-1-EGFP蛋白浓度达200 μmol/L时对细胞仍无毒性.结论 PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础.
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细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1对百草枯中毒大鼠肾损伤的影响
目的 探讨细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1对急性百草枯(PQ)中毒大鼠肾损伤的影响.方法 选126只成年健康SD大鼠(雌雄不拘)随机分为对照组、染毒组和干预组各为42只.染毒组给予20％百草枯稀释液l ml(25 mg/kg),腹腔内一次性注射.对照组大鼠给予等量0.9％氯化钠溶液腹腔内注射,干预组在染毒后通过左侧髂静脉给予1 mg融合蛋白PEP-1/HO-1.于1、6、12、24、36、48、72h,每组各取6只,在乙醚麻醉下,开腹,由腹主动脉采血,观察比较血浆中尿素氮(Bun)、肌酐(Cr)含量的变化,留取肾组织标本,一部分标本制备匀浆,分别测定肾组织中丙二醛(MDA)含量及总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活力;另一部分标本,用免疫组织化学染色法检测其HO-1蛋白的表达水平.结果 与对照组比较,染毒组和干预组6～72 h血浆Bun、Cr含量明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).与染毒组比较,干预组6～72 h血浆Bun、Cr含量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).染毒组1～48 h及干预组1～36 h MDA含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01).干预组1、6、12、24及36 h MDA含量较染毒组明显降低,差异有统计学意义(p＜0.05).与对照组比较,染毒组1～36 h T-SOD活力明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).干预组各时段T-SOD活力均较染毒组明显升高,差异有统计学意义(p＜0.01).肾组织免疫组化检测显示,各时间段染毒组和干预组较对照组HO-1蛋白的表达明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);干预组各时段HO-1表达较染毒组增强,差异有统计学意义(P＜0.01或0.05).结论 细胞穿透肽PEP-1可以将HO-1成功导入肾组织细胞内,导入的HO-1通过抑制脂质过氧化反应减轻PQ中毒引起的肾损伤.
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细胞穿透肽PEP-1导入血红素加氧酶-1蛋白对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响
目的 评价细胞穿透肽PEP-1导入血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响.方法 健康雄性SD大鼠18只,周龄7～9周,体重210 ～ 260 g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=6):假手术组(S组)、肾缺血再灌注组(I/R组)和融合蛋白PEP-1/HO-1+肾缺血再灌注组(HO组).采用夹闭双侧肾动脉45 min恢复灌注的方法制备大鼠肾缺血再灌注损伤模型.HO组于夹闭双侧肾动脉前30 min时静脉注射融合蛋白PEP-1/HO-1.于再灌注6h时取右侧颈总动脉血样,测定血清BUN和Cr浓度；取肾组织检测MDA含量和SOD活性；采用免疫组化法检测肾组织HO-1的表达.结果 与S组比较,I/R组和HO组肾组织MDA含量、血清BUN和Cr浓度升高,肾组织SOD活性降低,HO-1蛋白表达上调(P＜0.05)；与I/R组比较,HO组肾组织MDA含量、血清BUN和Cr浓度降低,肾组织SOD活性升高,HO-1蛋白表达上调(P＜0.05).结论 细胞穿透肽PEP-1将HO-1蛋白成功导入肾组织,导入的HO-1蛋白通过抑制脂质过氧化反应减轻肾缺血再灌注损伤.
关键词： 血红素氧化酶(脱环) 再灌注损伤 肾 细胞穿透肽 -
细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1对大鼠肠缺血再灌注损伤的影响
目的 评价细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1(HO-1)对大鼠肠缺血再灌注损伤的影响.方法 雄性SD大鼠18只,周龄7～9周,体重210～260 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为3组(n=6):假手术组(S组)、肠缺血再灌注组(IR组)和融合蛋白PEP-1/HO-1+肠缺血再灌注组(HO组).采用夹闭肠系膜上动脉45 min,恢复灌注120 min的方法制备大鼠肠缺血再灌注损伤模型.HO组夹闭肠系膜上动脉前30 min,左侧髂静脉注射融合蛋白PEP-1/HO-1 0.5 mg,S组不夹闭肠系膜上动脉,余操作同IR组.于再灌注120 min时处死大鼠取小肠组织,称重后计算肠湿/干重比,测定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和HO-1活性,免疫组化法检测肠组织HO-1蛋白的表达,光镜下观察肠组织结构并进行损伤评分.结果 与S组比较,IR组和HO组肠湿/干重比和MDA含量升高,SOD活性降低,HO-1活性和蛋白表达水平升高,损伤评分升高(P＜0.05);与IR组比较,HO组肠湿/干重比、MDA含量降低,SOD活性升高,HO-1活性和蛋白表达水平升高,损伤评分降低(P＜0.05).HO组大鼠肠组织病理学损伤较IR组减轻.结论 细胞穿透肽PEP-1可将HO-1成功导人大鼠肠组织中的细胞并减轻肠缺血再灌注损伤.
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细胞穿透肽PEP-1介导的血红素加氧酶-1对大鼠肠缺血再灌注诱发肝损伤的影响
目的 评价细胞穿透肽PEP-1介导的血红素加氧酶-1(HO-1)对大鼠肠缺血再灌注诱发肝损伤的影响.方法 雄性SD大鼠24只,7～9周龄,体重210～260 g,采用随机数字表法,将其分为3组(n=8):假手术组(S组)、肠缺血再灌注组(I/R组)和融合蛋白PEP-1/HO-1组(HO组).采用夹闭肠系膜上动脉45 min,恢复灌注120 min的方法制备大鼠肠缺血再灌注模型.HO组于缺血前30 min经左侧髂静脉注射融合蛋白PEP-1/HO-1 0.5 mg,S组仅分离闭肠系膜上动脉,但不夹闭.于再灌注120 min时,右侧颈总动脉取血样,测定血清AST和ALT的活性；然后处死大鼠,取肝组织,光镜下观察病理学结果,测定MDA含量和SOD活性.结果 与S组比较,I/R组和HO组血清AST和ALT的活性升高,肝组织MDA含量升高,SOD活性降低(P＜0.05)；与I/R组比较,HO组血清AST和ALT的活性降低,肝组织MDA含量降低,SOD活性升高(P＜0.05),肝损伤减轻.结论 细胞穿透肽PEP-1介导的HO-1可减轻大鼠肠缺血再灌注诱发的肝损伤.
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多肽介导的生物活性分子细胞靶向及胞内运输策略
细胞膜屏障在保护细胞正常形态和功能的同时,也使很多有治疗作用的生物活性分子难以进入细胞内,使其应用受到极大限制.目前常用的向细胞内导入生物大分子的方式主要有电穿孔和脂质体转染等,但因其对细胞有较大毒性而多局限于体外实验研究.近年来,基于多肽的药物输送载体以其安全性、低毒性、低免疫反应性、靶向性及易于组装等优点被寄予厚望.本文就多肽在生物活性分子胞内运输过程、提高输送效率的策略作一综述.
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促进细胞穿透肽及其介导的生物分子从内含体逃逸的几种策略
细胞穿透肽(CPPs)是一类可穿透细胞膜、向细胞内输送各种大分子生物活性物质的短肽.几乎所有CPPs及其介导的生物活性分子都是以内吞形式进入细胞,之后局限于内含体内,以至于终被溶酶体消化降解,从而影响了CPPs的运输效率,故寻找辅助CPPs及其介导的生物活性分子从内含体中逃逸进入胞浆的方法尤为重要.目前的体外研究多用氯喹或Ca<'2+>处理以提高CPPs的运输效率.近有学者报道使用天然多肽或微生物的某些"元件"(如,流感病毒的HA2肽)来协助CPPs从内含体逃逸,将有助于CPPs作为高效运载工具向细胞内输送生物活性分子.
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细胞穿透肽PEP-1在蛋白转导中的应用
文章对细胞穿透肽PEP-1在大分子物质体内外跨膜转导中的应用进行了综述,为进一步研究PEP-1介导有潜在治疗价值的大分子物质跨膜转导进行疾病的蛋白治疗提供了依据.
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PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响
目的:评价细胞穿透肽4即蛋白转导结构域4(PTD4)介导的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤(HRI)的影响.方法:用厌氧(85％N2、10％ H2 、5％ C02)培养箱制作大鼠心肌细胞(H9 C2) HRI模型,设置HRI组(HRI的细胞培养液中不加任何处理因素)、HRI+Cu/Zn SOD组(加入10 μmol·L-1 Cu/Zn SOD)、HRI+ PTD4-Cu/Zn SOD组(10μmol·L-1 PTD4-Cu/Zn SOD),另外以正常培养心肌细胞作为正常对照组,孵育30 min后,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术检测心肌细胞凋亡,蛋白印迹法检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果:HRI+ PTD4-Cu/Zn SOD组心肌细胞凋亡指数[(10.20±2.77)％]比HRI组[(28.40±2.41)％]明显降低,与HRI组比较,HRI+ PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白能显著增加Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白表达.结论:PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白可以减轻大鼠心肌细胞的HRI.
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粉尘螨变应原ProDerf1编码基因重组pET28a-YARA-Ihc体系的构建及表达
目的：构建粉尘螨变应原ProDer f 1原核表达载体pET28a-YARA-IhC-ProDer f 1，为评价其免疫治疗效果奠定基础。方法用分子克隆技术构建出表达载体pET28a-YARA-IhC-ProDer f 1，在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-IhC-ProDer f 1，并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果经测序证实成功构建了表达载体pET28a-YARA-IhC-ProDer f 1，YARA-IhC-ProDer f 1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达，纯化后的蛋白浓度为278μg/ml。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-IhC-ProDer f 1。结论已成功制备出pET28a-YARA-IhC-ProD-er f 1原核表达载体，融合蛋白得到表达和纯化。
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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及酶活性
目的 研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导人大鼠肝脏组织的能力及其酶活性.方法 实验分为SOD1组和PEP1-SOD1组,分别经尾静脉注射500 μg SODI和500 μg PEP-1-SOD1融合蛋白人大鼠体内,于0.5,1,2,4,8和24 h时间点取肝脏(n=6,每组,每个时间点).免疫荧光技术检测PEP-1-SOD1的转导能力.黄嘌呤氧化酶法测定肝脏组织SOD1活性.结果 SOD1蛋白不能进入肝脏组织内.PEP-1-SOD1可转导入肝脏组织内,SOD1活性于注射后0.5 h开始升高,1 h达高峰,持续存在达24 h,两组各个时间点比较,差异有统计学意义(P＜0.01).SOD1组内各时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PEP-1-SOD1以天然酶活性形式转导入肝脏组织,为进一步的动物模型实验及临床疾病进行蛋白质治疗提供理论基础.
