首页 > 文献资料
-
粉尘螨蛋白致敏小鼠肺部变应性炎症模型的建立
呈明显炎症病理改变;BALF中细胞总数、淋巴细胞数和嗜酸性粒细胞计数明显升高(P<0.01);BALF中IL-4明显升高(P<0.01),IFN-γ显著降低(P<0.01);脾细胞培养上清中IL-4也明显升高(P<0.01),IFN-γ显著降低(P<0.01).结论 用腹腔注射粉尘螨蛋白致敏后再雾化激发的方式能够在C57BL/6小鼠体内成功构建肺部变应性炎症模型.
-
粉尘螨变应原(Der fI)对DC2.4细胞的作用及其诱发哮喘机制的初步研究
分别通过对DC2.4细胞白介素-12(IL-12)和IL-10的ELISA检测,蛋白酶激活受体(PAR-2)的基因表达和丝裂原活化蛋白酶(MAPK)p44/42的磷酸化来观察Der fI对DC2.4细胞的作用及其诱发哮喘机制的初步研究.Der fI作用于DC2.4细胞的结果显示,Der fI可促进DC2.4细胞IL-10的分泌(P<0.01),抑制IL-12的分泌(P<0.05),但信号通路抑制剂U0126可以逆转细胞因子的分泌模式;促进磷酸化p44/42MAPK的表达(尤其是促进p42的磷酸化);抑制PAR-2受体的表达并呈时间依赖性.Th1/Th2失衡及Th2细胞功能亢进是过敏性哮喘的免疫基础,Th2型免疫应答可能是哮喘发生的机制之一.本研究中由于Der fI 作用于DC2.4细胞后抑制初始T细胞向Th1细胞分化而促使其向Th2细胞分化从而促使Th2型免疫应答.进而诱发过敏性哮喘,信号通路p44/42 MAPK的磷酸化加强和PAR-2受体表达的抑制也在诱发过敏性哮喘过程中起到促进作用.
-
粉尘螨Der f18变应原的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定
通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出Der f18片段,将Der f18连接到pET-24a表达载体上并转化到表达菌BL21(DE3)中,得到重组质粒pET-Der f18和重组工程菌.重组工程菌经IPTG诱导培养,高效表达出Der f18蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物约为52 kDa.表达产物经亲和层析纯化,用Western blot方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性.
-
粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA原核表达质粒的构建与表达
目的构建粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒,并在大肠埃希菌中表达. 方法采用亚克隆技术,用SacⅠ和NotⅠ从重组质粒pMD-18T- Der f 2上切下Der f 2 cDNA片段,插入表达载体pET-32a(+)质粒,转化大肠埃希菌BL21,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定.重组质粒pET-32a(+)-Der f 2转化大肠埃希菌,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析. 结果对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得455 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,证明已成功构建携带Der f 2基因的重组原核表达质粒pET-32a(+)-Der f 2.核酸序列测定及同源性分析证实,所构建的原核表达质粒pET-32a(+)-Der f 2中所含的Der f 2 cDNA片段与GenBank中的Der f 2序列同源性达到100%.Der f 2 cDNA在大肠埃希菌诱导表达后获得分子质量单位为34 ku的蛋白,蛋白含量占菌体蛋白含量的16%. 结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET-32a(+)-Der f 2,并在大肠埃希菌中获得高效表达,为获得重组纯化Der f 2变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础.
-
候选螨性口服液疫苗抗原标准化的初步研究
目的为螨性疫苗及其原材料标准化的检测、质量的监控以及进一步开发提供相应的技术. 方法应用层析介质以及蛋白沉淀技术从螨代谢培养基中分离数种重要的以及国际公认的螨性分泌排泄致敏蛋白Dff F1、Dff F2、Der fⅡ和Der fⅢ,经临床检验和放射性变应原吸附试验(RAST)等鉴定其免疫原性后,分别制备抗血清,再结合免疫学试验对疫苗制剂进行抗原的标准化分析. 结果 4种成分除Dff F1外,均呈较强的变应原性,且与哮喘病人血清IgE显示出高结合率;火箭电泳峰清晰明了,ELISA的A值与对照组比较差异有显著性. 结论纯化的Dff F1、Dff F2、Der fⅡ和Der fⅢ致敏蛋白多克隆抗体结合免疫相关技术完全可以用于检测候选螨性疫苗口服液制剂中抗原的性质、含量等,以及进行标准化分析.
-
粉尘螨两种溶性抗原糖蛋白的组分与糖链研究
目的研究水溶性和尿素溶性粉尘螨糖蛋白的组分及结合糖链的构成. 方法用粉尘螨脱脂干粉提取水溶性抗原(Der fA)和尿素溶性抗原(Der fU),经SDS-PAGE,Western blot,免疫染色,胶体金染色和糖定性检测两种抗原糖蛋白的组分,并用9种HRP-植物血凝素进行结合糖链鉴定. 结果 Der fA显示4条蛋白带,分别为18 ku、30 ku、50 ku和58 ku,Der fU显示2条蛋白带(46 ku、58 ku),其中58 ku糖蛋白检测阳性.Der fA存在α-甘露糖(α-Man)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAC)、α-葡萄糖(α-Glc),不存在寡糖(Oligosaccharide)、岩藻糖(α-Fuc)、β-半乳糖(β-Gal)、β-半乳糖-乙酰氨基半乳糖(β-Gal-GalNAC)及唾液酸(AS);Der fU只存在α-甘露糖,不存在其它7种糖链和唾液酸. 结论α-甘露糖是粉尘螨优势糖蛋白,其次是N-乙酰葡萄糖胺和α-葡萄糖.
-
粉尘螨变应原明胶微球口服免疫动物的脱敏效果
目的研究粉尘螨变应原明胶微球经口服免疫小白鼠后的脱敏疗效. 方法以粉尘螨变应原明胶微球(含粉尘螨变应原2×10-5 mg )口服免疫小白鼠,以ELISA法检测35 d内血清特异性IgG水平变化.并以腹腔注射相同剂量的粉尘螨变应原浸液的小白鼠为对照实验,以口服不含粉尘螨变应原的空白明胶微球的小白鼠为空白实验. 结果口服粉尘螨变应原微球的小白鼠实验组可产生高水平的血清抗体,在给药后第14 d抗体高值为2.45×105 Au/ml(Arbitrary units per milliliter),高于腹腔注射相同剂量的粉尘螨变应原浸液小白鼠的高抗体水平(4.27×104 Au/ml). 结论在给予相同剂量粉尘螨变应原的前提下,明胶微球口服制剂的免疫效果优于变应原浸液腹腔注射剂.
-
粉尘螨变应原Der f Mal f 6的克隆、表达及生物信息学分析
目的 克隆粉尘螨变应原Der f Mal f 6(简称Mal f 6)编码基因并构建其原核表达体系. 方法 提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的(AY283280.1)序列设计并合成引物,RT-PCR扩增Der f Mal f 6全长基因,克隆至pColdTF DNA载体,转化至E.coli JMI09,取阳性克隆测序；将pCold TF-Mal f 6质粒转化至BL21,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE验证表达产物,采用生物信息学软件预测Mal f 6的理化特性、结构和功能. 结果 RT-PCR获得全长为495 bp的Mal f 6基因.原核表达后经SDS-PAGE电泳显示其全细胞、上清及沉淀物均有蛋白表达,以上清表达量较高.生物信息学分析该蛋白由164个氨基酸组成,分子质量单位为17.7 ku,二级结构由α螺旋(4.88％)、延伸主链(37.8％)和无规则卷曲(57.32％)组成,是亲水性细胞质蛋白,具有肽酰-脯氨酰反式异构酶活性. 结论 粉尘螨变应原Mal f 6原核表达获得成功,为该变应原的进一步研究及规模生产和应用奠定了基础.
-
尘螨变应原Der f2编码基因重组pCold TF体系构建及可溶性表达
目的 建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系并诱导表达. 方法 以质粒pMD19-T- Der f 2为模板扩增目的基因Der f 2,克隆至pCold TF DNA载体,转化BL21细菌,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pCold TF-Der f 2.SDS-PAGE检测表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达,表达产物分子质量单位为69 ku,Western blot检测该蛋白能被鼠抗Penta-His抗体识别. 结论 成功建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系,并实现其可溶性原核表达.
关键词： 粉尘螨 变应原(Der f 2) 基因重组 原核表达 -
粉尘螨变应原第16组分基因克隆及表达
目的 获得粉尘螨变应原第16组分(Der f 16)编码基因并构建其原核表达体系.方法 提取粉尘螨总RNA,根据GenBank (AF465625)设计并合成引物,经RT-PCR合成Der f 16全长基因,克隆至pCold TF DNA载体,热转化至E.coli JM109;将测序正确的pCold TF- Der f 16质粒转化BL21 (DE3),IPTG诱导表达,并用SDS PAGE验证产物.结果 RT PCR扩增获得目的基因Der f 16,全长1 443 bp,与参考序列同源性99.72％.将构建的pCold TF-Der f16质粒转化宿主菌E.coli BL21后进行诱导,SDS-PAGE电泳显示其全细胞、上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物.生物信息学分析显示该重组蛋白由480个氨基酸组成,分子质量单位为55.1315 ku,二级结构由(-螺旋(35.21％)、延伸主链(20.83％)和无规卷曲(43.96％)组成.该变应原含有4个凝溶胶蛋白位点.结论 粉尘螨变应原第16组分原核表达获得成功,为进一步规模生产该变应原并应用于临床诊治奠定了基础.
-
粉尘螨浸液免疫治疗螨性哮喘患者的免疫功能观察
目的探讨粉尘螨变应原浸液免疫治疗对螨性哮喘患者免疫功能的影响. 方法用粉尘螨浸液和平喘药分别对实验组和对照组螨性哮喘患者进行免疫治疗和对症治疗,用ELISA法检测患者治疗前、后血清总IgE、螨特异性IgE、螨特异性IgG、IL-2 和 IL-4水平,用生物素-链霉亲和素法检测患者治疗前、后外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+. 结果患者血清总IgE、螨特异性IgE、螨特异性IgG治疗前分别为(292.35±112.46) IU/ml、(251.68± 125.15) IU/ml和(587.64±354.68) IU/ml,治疗后分别为(265.74±124.67) IU/ml、(297.56±172.27) IU/ml和 ( 824.51±428.26) IU/ml,两者相比,螨特异性IgG显著上升(P<0.01).外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+治疗前分别为(55.87±7.23)%、(38.43±6.43)%、(30.14±5.24)%和1.26±0.56,治疗后分别为(65.83±6.55)%、(42.72± 6.26)%、(28.57±4.67)%和1.58±0.62,CD4+/CD8+比值上升,差异显著(P<0.05～P<0.01);治疗前、后IL-2和IL-4的水平分别为(2.16±0.38) pg/ml、(3.49±0.57) pg/ml和(1.64±0.82) pg/ml、(1.03±0.78) pg/ml,差异均具显著性(P<0.01). 对照组治疗前后上述免疫学指标均无显著变化. 结论螨性哮喘患者免疫治疗后,螨特异性IgG升高, 对IgE介导的Ⅰ型变态反应具一定抑制作用.细胞免疫变化似有Th2型反应受抑制,Th1型反应增强的趋势.
-
粉尘螨全长cDNA文库的构建及初步鉴定
目的 构建粉尘螨全长cDNA文库,为粉尘螨相关基因研究奠定基础. 方法 用RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨总RNA,然后以SMART IVTM Oligo-nucleotide和CDSⅢ/3' PCR Primer为引物,在反转录酶作用下合成cD-NA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链.合成的双链cDNA经蛋白酶K消化及Sfi Ⅰ酶切,得到的cDNA克隆入λTripIEx2载体中,构建粉尘螨全长cDNA文库,测定分析文库滴度及插入片段大小. 结果 成功构建粉尘螨全长cDNA文库.检测cDNA文库未扩增时滴度为7.3×106 pfu/ml,文库扩增后滴度为5.0×109 pfu/ml,插入片段为0.5～2.5 kb,平均1.2 kb左右. 结论 成功构建了高质量的粉尘螨全长cDNA表达文库,所建文库容量及插入片段大小适用于对粉尘螨相关基因的进一步研究.
-
重组粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达及纯化
目的 表达并纯化粉尘螨2类变应原Der f 2蛋白,检测其变应原性. 方法 用1 mmol/L的IPTG诱导含重组质粒pET30a-Der f2的大肠埃希菌BL21( DE3),SDS-PAGE电泳检测并纯化目的蛋白,ELISA检测其与尘螨哮喘患者血清IgE的结合活性. 结果 SDS-PAGE电泳检测重组质粒pET30a-Der f 2表达产物,其分子质量单化为15 ku,与预期大小相符.ELISA检测纯化的Der f 2蛋白可与尘螨哮喘患者血清IgE反应. 结论 成功获得并纯化了Der f2重组蛋白,该蛋白具有变应原性,为进行尘螨过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗的动物实验奠定了物质基础.
-
粉尘螨变应原Der f 2在毕氏酵母中表达及圆二色谱分析
目的 克隆粉尘螨变应原Der f 2编码基因,并构建毕氏酵母表达体系,对表达产物进行圆二色分析. 方法 提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的序列设计并合成简并引物,PT PCR扩增Der f 2全长基因,与pGAPZα-A载体连接后转化至E.coli Top10F,取阳性克隆并测序;将pGAPZα-A-Der f 2用Bln Ⅰ进行线性化,电转化至GS115感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,采用SDS-PAGE验证表达产物,用His Trap HP亲和柱纯化重组蛋白Der f2,进行圆二色谱扫描分析. 结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pGAPZα-A-Der f 2,SDS-PAGE验证表明该质粒在GS115感受态细胞中正常表达,表达产物分子质量单位为14.9 ku,重组蛋白Der f 2纯化后进行圆二色谱数据分析,其二级结构α-螺旋占41.2％,转角占10.3％,β-折叠占26.8％,不规则卷曲占21.7％. 结论 尘螨变应原Der f2在毕氏酵母中成功表达,为该变应原的进一步研究及规模生产和应用奠定了基础.
-
螨成虫抗原间接荧光抗体试验检测肺螨病
肺螨病是某些螨类经呼吸道侵入人体寄生于肺部而引起的一种疾病,并在特定的人群中有较高的感染率和发病率[1],因该病无特殊的临床表现,加之痰检较为繁杂,技术要求高,故而诊断困难.为了寻找一种简便可靠的免疫学诊断方法,作者以粉尘螨成螨作抗原,应用间接荧光抗体试验,对58例肺螨病患者的血清进行了检测,现将结果报道如下.
-
粉尘螨和屋尘螨饲养及分离技术研究进展
粉尘螨和屋尘螨是目前国内外纺织品防螨检测测试中使用的标准测试虫种.为了进一步促进我国检测机构开展相关业务,提高业务水准,有必要关注该领域的国内外研究动态.本文对粉尘螨和屋尘螨的人工饲养和分离等相关技术进行了综述.
-
粉尘螨浸液的凝胶分析与免疫活性测定
目的研究粉尘螨浸液的变应原成分及其活性.方法取实验室人工培养的粉尘螨,制备粉尘螨浸液,以Sephadex G-75、Sephadex G-200凝胶柱层析,收集各管洗脱液进行皮肤挑刺试验.结果粉尘螨浸液经Sephadex G-75柱层析后,洗脱液的A值呈现双峰,能引起皮肤红晕或风团的洗脱液主要位于两峰之间接近第1峰处;经Sephadex G-200柱层析后呈3峰,能引起皮肤红晕或风团的洗脱液主要位于两峰之间接近第2峰处.结论具有免疫学活性的粉尘螨变应原位于第1峰、第2峰及两峰之间,是免疫诊断和治疗所需组分.
-
屋尘螨和粉尘螨Ⅰ类变应原研究进展
屋尘螨和粉尘螨是常见的室内过敏原之一,尘螨主要的致敏成分是尘螨Ⅰ类变应原.该文从屋尘螨和粉尘螨Ⅰ类变应原的研究概况、在螨体内的定位、结构和生化特性研究与同源性和多态性分析、应用于尘螨变应原研究的新方法等4个方面进行综述.
-
粉尘螨变应原第5组分基因克隆及分子特征分析
目的 获得粉尘螨变应原第5组分的编码基因(Der f5)并了解其分子特征.方法 用RNAiso试剂盒提取粉尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der f5核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T Simple载体进行序列测定和分析.结果 获得的Der f5基因与参考序列(GenBank AY283283)同源性达97.8%,含1个完整的开放阅读框架(ORF),由132个氨基酸组成,信号肽位于1～19AA、跨膜区域位于1～19AA,为细胞外疏水性蛋白.二级结构由延伸主链(1.52%)、无规则卷曲(7.58%)和α螺旋(90.91%)组成.具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点2个.其氨基酸序列与屋尘螨变应原第5组分相似率为78%.结论 成功克隆了 Der f5,并初步预测得其分子特征.
-
细菌内毒素对粉尘螨诱导的哮喘小鼠肺部炎症的免疫调节
目的 了解不同时间给予细菌内毒素对过敏性哮喘小鼠炎症反应的免疫调节作用.方法 将60只小鼠随机分成4组,分别为模型组(Der f)、对照组(生理盐水)、实验A组(致敏前LPS+Der f)、实验B组(致敏后LPS+Der f),观察肺组织病理学变化并进行支气管肺泡灌洗液(BALE)细胞计数与分类,ELISA法检测小鼠BALF与脾细胞培养液中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-12及血清中特异性IgE、IgG2a水平.结果 与模型组比较,实验A组的BALF中炎细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)、IL-4、IL-5显著降低,而IL-12显著升高(P均＜0.05),血清中特异性IgE(sIgE)显著降低,而特异性IgG2a(sIgG2a)显著升高(P均＜0.05);与哮喘组比较,实验B组仅BALF中IL-4水平显著升高(P＜0.05).结论 致敏前LPS能显著抑制过敏性哮喘的炎细胞浸润并下调TH2型免疫反应,而致敏后LPS未显示此功能,提示LPS致敏前给予对过敏性哮喘的发生有保护作用.
