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Elafin基因重组气道上皮调节脂多糖诱导的人气道黏液高分泌
目的 探讨天然内生多肽Elafin对脂多糖诱导的气道黏液高分泌的调节机制.方法 构建人Elafin重组质粒pEGFP-N1-Elafin,转染正常人支气管上皮细胞HBE16,给予脂多糖(LPS)刺激,激光共聚焦扫描显微镜检测Elafin蛋白含量,Western blot法检测IKBa蛋白含量;荧光素酶报告基因检测系统测定核转录因子-κB(NF-κB)活性;RT-PCR检测Elafin和黏蛋白(MUC)SAC mRNA表达水平;ELISA法分析MUCSAC蛋白相对含量.结果 成功构建内生多肽Elafin真核表达载体pEGFP-N1-Elafin并转染HBEi6细胞.转染重组Elafin后Elafin蛋白含量及mRNA水平明显增加.与对照组相比,LPS刺激组IκBα蛋白含量降低,NF-κB相对活性明显增强,MUC5AC蛋白含量及mRNA水平也显著增加.转染重组Elafin后再予以LPS刺激,与单纯LPS刺激组相比,IκBα蛋白含量明显增加,NF-κB相对活性显著降低,MUCSAC蛋白含量及mRNA水平也明显降低.结论 天然内生多肽Elafin重组气道上皮可下调NF-κB的活性,降低脂多糖诱导的气道黏液高分泌.
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转染重组人Elafin基因保护NCI-H292细胞系
目的 探讨转染重组人白细胞弹性蛋白酶抑制剂内生多肽(Elafin)基因保护气道上皮的分子机制. 方法 构建人Elafin重组质粒pEGFP-C1-Elafin,并转染入人气道黏膜上皮细胞系NCI-H292细胞,将其与多形核粒细胞(PMN)共孵育,经脂多糖(LPS)刺激24 h后,用Western blot检测细胞中紧密连接相关蛋白ZO-1的表达及MTT法测定细胞与胶原的附着能力. 结果 经LPS刺激后,Western blot及MTT法发现,与对照组和转染重组质粒组相比,转染空载体的NCI-H292细胞中ZO-1的表达及细胞与胶原附着能力均明显降低(P＜0.01);而与对照组相比,转染重组质粒的细胞中ZO-1的表达及细胞与胶原附着能力均未见明显下降. 结论 通过转染重组人Elafin可保护气道上皮,增强气道抵抗炎性损伤能力.
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Elafin在人支气管上皮细胞系16HBE胞质内对黏蛋白5AC生成的影响
目的 探讨Elafin在胞质内对表皮生长因子(EGF)诱导的黏蛋白(MUC)5AC生成的影响及其作用机制.方法 体外培养人支气管上皮细胞系16HBE,将已构建好的pEGFP-N1-Elafin载体通过LipofectamineTM2000转染到16HBE细胞中,以转染空质粒载体的16HBE细胞作为对照,均给予外源性EGF作为刺激物共同孵育.以RT-PCR和ELISA分别检测细胞内黏蛋白(MUC)5AC mRNA水平和MUC5AC含量.间接免疫荧光细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测细胞核中核因子(NF)-κB的活性.免疫共沉淀法结合Western blot检测SUMO-1-p-IκBα含量.结果 转染重组质粒的细胞中MUCSAC mRNA水平、MUCSAC的含量(0.36 ±0.09)以及NF-κB的活性显著低于转染空载体的对照组细胞(MUC5AC的含量0.55±0.07)(P<0.01),而SUMO-1-p-IκBα的含量则显著高于后者(P<0.01).结论 Elafin能够通过促进p-IκBα的类泛素化阻止NF-κB的活化,从而下调MUC5AC的生成.
关键词： Elafin 核因子-κB 小泛素样修饰蛋白-1 类泛素化 黏蛋白5AC -
Elafin重组气道上皮细胞对铜绿假单胞菌生物被膜的抗菌作用
目的 探讨Elafin重组气道上皮细胞对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)生物被膜(biofilm,BF)的抗菌作用.方法 体外平板法制备Pa生物被膜模型,用银染法及扫描电镜鉴定.体外培养A549细胞,将pEGFP-N1-Elafin重组到A549细胞,倒置荧光显微镜观察转染情况.采用猪胰弹性蛋白酶(NE组)、铜绿假单胞菌(Pa组)上清、大肠埃希杆菌(E.coli组)上清分别诱导孵育重组细胞24 h,另设转染未含Elafin基因空载体的A549细胞作为对照组.将成熟BF载体放入4组中继续孵育8 h,扫描电镜观察4组BF结构的变化,并于第8小时用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细菌存活数.结果 扫描电镜下观察到3个诱导组的BF结构较对照组的BF明显松散,尤以Pa组和NE组为甚;NE组[(3.238±0.316)×106 CFU/cm3]、Pa组细菌数量[(3.317±0.247)×106 CFU/cm2]均较对照组[(5.946±0.453)×106 CFU/cm3]显著减少(P＜0.01),E.coli组细菌数量[(5.138±0.391)×106 CFU/cm2]较Pa组和NE组减少,差异均有统计学意义(P＜0.01).3个诱导组BF细菌清除率与对照组相比分别为45.6%、44.2%和13.6%.结论 Elafin重组气道上皮细胞能有效清除Pa生物被膜中的细菌,而Pa产物也是Flafin表达的有效诱导物.
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弹性蛋白酶抑制物-elafin与女性压力性尿失禁
随着对女性压力性尿失禁(SUI)发病机制的深入研究,其分子生物学机制受到高度重视,弹性纤维作为盆底支持组织细胞外基质的重要功能性成分,赋予组织重要的弹性功能,若其功能受影响将导致支持组织失去弹性,盆底松弛,盆底功能障碍性疾病相继发生.弹性蛋白酶特异性抑制物elafin基因在女性SUI患者的阴道组织中高表达,可能与盆底组织弹性纤维的重塑有内在联系,构成女性SUI的发病基础.
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Elafin在气道炎症性疾病中的作用
Elafin是一种内源性的低分子量丝氨酸蛋白酶抑制剂,它来自于其前体trappin-2(或称pre-Elafin)的蛋白水解.Elafin的N端区段可以在转谷酰胺酶的介导下与细胞外基质铰连,而C端可以继续发挥抗蛋白酶作用.此外,Elafin还有抗感染、抗炎和免疫调节作用.因此,在气道炎症性疾病的治疗方面,Elafin是一种极具吸引力的候选分子.
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Elafin真核表达载体的构建及其对气道粘液高分泌的调节
目的:构建天然内生多肽Elafin真核表达载体,探讨其对气道粘液高分泌的影响.方法:抽提Elafin行RT-PCR获取Elafin cDNA,双酶切后将片段装载到pMD18-T载体上.以pMD18-T-Elafin为模板行PCR反应,产物胶回收并双酶切后定向克隆至pEGFP-N1上,转化,筛选,双酶切鉴定重组质粒.将pEGFP-N1-Elafin转染正常人支气管上皮细胞HBE16,给予脂多糖(LPS)刺激,Western blot检测细胞内Elafin蛋白的相对含量,RT-PCR检测各组Elafin mRNA和粘蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,荧光素酶报告基因检测系统测定核转录因子-κB(NF-κB)的活性;ELISA法分析各组细胞MUC5AC蛋白的相对含量.结果:成功构建Elafin真核表达载体,转染重组Elafin的HBE16细胞成功表达Elafin蛋白.LPS刺激可增强NF-κB 的活性,该活性在转染重组Elafin后显著降低;MUC5AC蛋白含量及mRNA水平在LPS刺激后也显著升高,在转染重组Elafin后二者的表达水平明显降低.结论:Elafin真核表达载体成功构建,初步发现Elafin可通过降低NF-κB 的活性来下调MUC5AC的表达,为进一步深入研究其对气道粘液高分泌的调节机制奠定了基础.
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人肺新型抗蛋白酶性保护因子elafin cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建
目的 克隆人肺新型抗蛋白酶性保护因子elafin基因cDNA,构建该基因的真核高效表达载体.方法 抽提人肺总RNA进行RT-PCR法扩增,产物由pUCm-T载体装载、DNA测序确定后,用双酶切将Elafin cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,转化于大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定重组质粒.结果 经RT-PCR获得400b的产物,经DNA测序,确定所扩增片段为人elafin基因cDNA,进而成功筛选出真核表达载体pEGFO-N1-elafin.结论 成功构建人elafin基因cDNA真核表达载体,为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础.
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重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性
目的 利用毕赤酵母表达系统表达BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白,并检测其生物学活性.方法 构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达,取上清,经阳离子交换层析纯化融合蛋白,并检测其反应原性、抗弹性蛋白酶活性及对SNARE蛋白复合体的裂解作用.结果 重组表达质粒pPIC9K-BONT-LH(N)-Elafin经双酶切及测序证实构建正确;表达的BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白相对分子质量约为110 000,纯化的融合蛋白纯度达92%,浓度为54 mg/L,反应原性良好,具有抗弹性蛋白酶活性及裂解SNARE蛋白复合体的作用.结论 已在毕赤酵母GS115中成功表达了重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究其抑制气道黏液高分泌的机制奠定了基础.
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Elafin在肿瘤坏死因子-α诱导的炎性反应中的抗炎机制
目的 探讨Elafin的抗炎机制.方法 体外培养人支气管上皮细胞系16HBE细胞,将已构建好的pEG-FP-N1-Elafin载体转染到细胞中,并以空质粒载体作其对照,以外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α作为刺激物共同孵育.间接免疫荧光细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测细胞核中核因子(NF)-κB的活性,ELISA检测细胞上清液中炎性介质(选取IL-1β、IL-8作为代表)的含量,免疫共沉淀法结合Western blot检测小泛素样修饰蛋白(SUMO)-1-p-IκBαt含量.结果 重组质粒组的细胞中NF-κB的活性和IL-1β、IL-8的生成量与空质粒载体组细胞相比明显降低,而SUMO-1-p-IκBα的含量则显著升高(P＜0.01).结论 Elafin能够通过促进IκBα的类泛素化阻止NF-κB的活化,下调前炎性介质的生成,从而发挥其抗炎作用.
关键词： Elafin 核因子-κB 小泛素样修饰蛋白-1 类泛素化 抗炎作用 -
Elafin与皮肤疾病
Elafin是中性粒细胞弹力蛋白酶( neutrophil elastase,NE)的内源性特异性抑制物,通过拮抗NE作用发挥其抗增殖、抗炎症等作用。 Elafin参与黑素瘤、银屑病、血管炎、移植物宿主病等多种皮肤疾病的发生发展。本文就Elafin在某些皮肤疾病中的作用加以综述。
关键词： Elafin 中性粒细胞弹性蛋白酶 -
转染重组Elafin对炎症状态下巨噬细胞表面受体CD14的保护作用
目的:研究转染重组Elafin对炎症状态下巨噬细胞表面受体CD14的保护作用.方法:重组质粒pEG-FP-C1-Elafin转染入离体培养巨噬细胞株,与多形核中性粒细胞(polymorphonuclear granulocyte,PMN)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共作用4h后,倒置荧光显微镜观察重组Elafin胞内表达,流式细胞仪检测巨噬细胞表面受体CD14表达情况.同时,转染重组质粒的巨噬细胞与凋亡PMN共孵育1h后,观测结合凋亡PMN的巨噬细胞百分比.结果:pEGFP-C1-Elafin转染入巨噬细胞后被成功表达,其表面受体CD14数量明显升高,结合凋亡PMN的巨噬细胞的数量的增加.结论:通过转染重组人Elafin,可保护炎症状态下巨噬细胞表面凋亡相关受体CD14,促进PMN凋亡.
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天然抗菌多肽elafin重组腺病毒载体构建及气道上皮细胞表达
目的 构建天然抗菌多肽elafin基因高效表达载体--重组腺病毒载体,并探讨其在肺上皮细胞中的初步表达.方法 提取人肺总RNA,进行elafin基因逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增,PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上;在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得腺病毒载体Ad-elafin;继之在293细胞内扩增,利用报告基因荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度和感染效率;重组腺病毒Ad-elafin转染原代培养的气道上皮细胞,24 h后荧光显微镜观察GFP表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清液中elafin的含量.结果 测序、酶切及PCR证实天然抗菌多肽elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功,同时转染气道上皮细胞24 h后荧光显微镜可见GFP的表达,且转染组细胞上清液中elafin测定值为(2.4±0.4)ng/ml与对照组(1.9±0.3)ng/ml相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 elafin基因重组腺病毒载体成功构建,有利于elafin生物特性的研究.
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Elafin对气道上皮细胞黏蛋白5AC的调节作用
目的 探讨天然内生多肽Elafin对气道上皮细胞黏蛋白5AC(MUC5AC)的调节作用.方法 通过培养气道上皮细胞,选择采用香烟烟雾提取物(CSE)以及脂多糖(LPS)作为刺激因素,使用细胞免疫荧光法以及ELISA法,分别检测各组气道上皮细胞MUC5AC的胞内蛋白以及胞外蛋白分泌的表达情况.结果 单纯LPS刺激组细胞内的MUC5AC蛋白的分泌水平为(0.785±0.005)μg/ml,单纯CSE刺激组细胞内的MUC5AC蛋白的分泌水平为(0.803±0.005)μg/ml,均较对照组明显增多(均P<0.01).在LPS刺激前予Elafin预处理组细胞内的MUC5AC蛋白的分泌水平为(0.363±0.003)μg/ml,显著低于单纯LPS刺激组(P<0.01).在CSE刺激前予Elafin预处理组细胞内的MUC5AC蛋白的分泌水平为(0.406±0.006)μg/ml,显著低于单纯CSE刺激组(P<0.01).单纯予Elafin处理组细胞内的MUC5AC蛋白的分泌水平先后为(0.176±0.002)μg/ml及(0.193±0.004)μg/ml (P<0.05),均较对照组显著降低.结论Elafin可以通过阻断气道黏蛋白的生成及分泌,从而达到抑制气道黏液高分泌的目的.
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核转录因子-κВ在中性粒细胞弹力酶诱导肺A549细胞Elafin表达中的作用
目的探讨在中性粒细胞弹力酶(NE)诱导肺上皮细胞表达Elafin过程中核转录因子-κВ(NF-κВ)的信号传导作用.方法肺上皮细胞株A549传代培养后分3组行条件孵育,分别为正常组、加精制猪胰NE孵育的对照组以及同时加酶和NF-κВ抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)孵育的实验组.孵育2 h后的细胞涂片行免疫荧光细胞染色法检测NF-κВ的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测孵育24 h上清液的Elafin水平.结果加入NE孵育的细胞上清液中的Elafin和NF-κВ的表达强度与空白对照组比较均有显著性差异(P<0.01);同时加入NE和PDTC孵育细胞的上述指标与NE组比较也存在显著性差异(P<0.05).培养细胞NF-κВ的表达强度与上清液中的Elafin呈显著正相关(r=0.66,P<0.01).结论 NE诱导肺上皮细胞Elafin表达的作用可能是通过激活NF-κВ来传导实现的.
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天然内生抗菌多肽elafin真核表达载体的构建及在真核细胞的表达
采用RT-PCR法提取天然内生抗菌多肽elafin的基因,通过测序确认后亚克隆构建真核表达载体pEGFP-N1-elafin,再转染至肺上皮细胞A549,荧光显微镜观察pEGFP-N1-elafin在细胞中表达及定位,采用Northern杂交、ELISA检测法分别从转录及蛋白质水平分析表达情况,后通过酶切电泳鉴定证实真核表达载体pEGFP-N1-elafin构建成功,其转染细胞中有elafin的基因表达,且细胞上清液中elafin含量证实其主要是分泌性表达.Elafin基因cDNA真核表达载体的成功构建以及主要呈分泌性表达的特点显示了极具意义的潜在应用价值.
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天然抗生素肽elafin与铜绿假单胞菌的相互作用
目的 观察天然抗生索肽elafin与铜绿假单胞菌的相互作用.方法 体外细胞培养气道上皮A549细胞,将已构建好elafin克隆载体通过脂质体转染系统转染到A549细胞中,空质粒载体作为其对照,倒置荧光显微镜观察转染效果.空载体转染A549细胞(正常组)以及转染后的A549细胞分别用细胞培养液(对照组)和铜绿假单胞菌上清液(实验组)继续孵育24h.用ELISA法检测每组细胞上清液中elafin水平,Western Blot法检测细胞内elafin含量;孵育24h后.每组上清液取1ml加入到铜绿假单胞菌菌悬液中培养24h,用倍比稀释法测细菌数量.结果 对照组细胞的上清液中elafin水平(2.93±0.41)和细胞内elafin蛋白含量(0.23±0.05),与正常组[(1.24±0.23)和(0.12±0.03)]有显著差异(均为P＜0.01).上述指标实验组[(8.54±0.99)和(0.74±0.18)]与对照组相比明显增加(均为P＜0.01);对照组细胞上清液中细菌数量[(5.62±0.75)×106/ml]与正常组细胞上清液中的[(6.78±0.98)×106/ml]也有差异(P＜0.05),实验组[(3.26±0.53)×106/ml]与对照组相比细菌数明显减少(P＜0.01).细胞上清液中elafin水平与细菌数呈一定的负相关(r=-0.59,P＜0.05).结论 铜绿假单胞菌能诱导elafin产生,反之elafin亦有一定的杀铜绿假单胞菌作用.
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中性粒细胞弹性蛋白酶和elafin蛋白与皮肤肿瘤
皮肤肿瘤组织中浸润的中性粒细胞及瘤细胞可以合成、分泌中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂elafin蛋白,共同参与了皮肤肿瘤的分化.中性粒细胞弹性蛋白酶能够促进瘤细胞增殖、扩散及转移,中性粒细胞弹性蛋白酶/elafin失衡可能参与了皮肤肿瘤的生长调控.中性粒细胞弹性蛋白酶和elafin在皮肤肿瘤中的作用机制值得深入研究.
关键词： 中性粒细胞弹性蛋白酶 Elafin 皮肤肿瘤
