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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5~8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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人骨肉瘤细胞系OS-732与血管生成的相关作用
一、材料与方法 1.细胞株和细胞培养:人骨肉瘤细胞株OS-732, 购自北京积水潭医院骨科实验室,常规培养于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液中。 2.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)制备及瘤细胞接种:选取孵育至9 d的胚蛋,参考付生法[1]的方法制备CAM,选择近胚头1 cm处的两条前卵黄静脉间的相对无血管区接种对数生长期OS-732细胞,每只5×106/100 μl,共接种10只。另10只设为空白对照组。于接种第2天至接种第9天在解剖显微镜下逐日观察接种区5 mm范围内血管数目及形态学变化。
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免疫缺陷小鼠肿瘤模型的建立及其肿瘤相关免疫机制的探讨
目的:观察不同免疫缺陷小鼠中的人肝癌细胞生长情况以及T,B淋巴细胞的免疫作用,探讨免疫缺陷小鼠肿瘤模型制作的意义.方法:将体外培养的人肝癌细胞接种到四种免疫缺陷小鼠,分别为:B细胞缺陷的CBA/N,T细胞缺陷的Balb/c-nu,T,B细胞缺陷的SCID及免疫重建的SCID小鼠,观察其生长特点;作鼠脾细胞毒试验,测定外周血CD4+,CD8+数分数和荷瘤鼠血清Ig含量的变化;作肝癌细胞凝集试验.结果:CBA/N和用BALB/c鼠外周血淋巴细胞重建的SCID(B-PBL-SCID)鼠不成瘤,nude、SCID和用CBA/N鼠外周血淋巴细重建的SCID-(C-PBL-SCID)小鼠全部成瘤;SCID鼠的瘤体比裸鼠瘤体长的更快,肝内接种转移率更高、转移范围更大.接种瘤细胞的BALB/c和CBA/N鼠脾细胞对癌细胞杀伤力较强,免疫重建的SCID鼠脾细胞毒杀伤较小.接种瘤细胞的鼠CD4+数分数都下降,CD8+变化不大,CD4+/CD8+比值下降.具有B细胞的实验鼠均测得Ig在mg@L1水平,并能使癌细胞产生凝集反应.结论:SCID鼠是建立肿瘤模型和免疫重建研究的理想小鼠;小鼠成瘤率与T细胞相关,T细胞在异种瘤移植排斥中起主要作用;B淋巴细胞及其产生的抗体在抗肿瘤中起着不可忽视的作用.
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MUC1基因免疫抑制H22肝癌生长的实验研究
目的:观察MUC1基因免疫对H22肝癌生长的特异性抑制作用.方法:采用股四头肌肌肉注射法将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫Balb/c小鼠,每次100μg,3wk/次,共3次.后一次基因免疫后3 wk,接种表达MUC1的H22肝癌细胞.2 wk后观察、记录肿瘤的生长情况.于肿瘤细胞接种后43d,处死全部动物,称肿瘤的质量.荷瘤小鼠的瘤组织常规HE染色.结果:肿瘤细胞接种后43d,MUC1预防组,质粒pcDNA3.1对照组及生理盐水阴性对照组H22肝癌大小分别为547±59 mm3,1185±84mm3和1220±95 mm3(P<0.01);平均瘤质量分别为1.87±0.96 g,4.19±1.34 g和4.23±1.32 g(P<0.01);pcDNA3.1对照组和生理盐水阴性对照组100%可见瘤体形成,肿瘤生长,而MUC1基因疫苗预防组仅见50%(5/10)的小鼠有瘤体形成,与对照组相比,MUC1预防组H22肝癌生长受到明显抑制(P<0.01);MUCI预防组小鼠免疫保护有显著差异(P<0.05).病理学检查结果显示,与pcDNA3.1对照组相比,MUC1 DNA疫苗预防组鼠H22肝癌组织大量坏死.结论:MUC1基因免疫显著抑制H22肝癌生长.
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抑制KAI1诱导的自噬对胰腺癌MiaPaCa-2细胞增殖及凋亡的影响
细胞自噬是一种重要的促细胞生存途径,同时也是一种不同于凋亡和坏死的死亡方式.KAI1是缺氧目的基因,体内缺氧时亦可诱导细胞自噬[1].我们前期报道了KAI1诱导MiaPaCa-2自噬,并增加细胞的存活[2],本研究进一步探讨抑制KAI1诱导的自噬对该细胞增殖及凋亡的影响.一、材料与方法1.CCK-8检测细胞增殖:应用KAI1抑制剂3-MA预处理MiaPaCa-2细胞1h,以未处理组作为对照,应用100 MOI的Ad5-KAI1及Ad5 -null分别感染细胞,具体步骤参考我们前期报道[3].取转染细胞接种96孔板,培养0.5、1、2、3、4、5d后每孔分别加人10μl的CCK-8( Dojindo Molecular Technologies公司,日本)继续培养1h,在酶标仪(Themo,Germany)测定450 nm吸光值(A450).每组设3个复孔,实验重复3次,取均值.
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自体富血小板血浆凝胶双相接种法构建组织工程骨
背景:使用富血小板血浆(PRP)等凝胶样物质作为接种介质的双相接种法可优化组织工程骨构建,但PRP的促成骨作用仍存在较大争议。目的:进一步探讨自体PRP凝胶用于双相接种法构建组织工程骨的可行性,及其促成骨性能。方法:实验组利用自体PRP凝胶接种骨髓间充质干细胞(MSCs)于β-磷酸三钙(β-TCP)支架构建组织工程骨,对照组采用常规的DMEM静态接种法构建。体外实验:通过MTT实验、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、骨钙素(OC)放免测定,比较两种方法对细胞增殖和成骨分化影响。体内实验:将构建材料植入兔桡骨大段骨缺损,通过组织学观察、X线检查、单光子发射计算机断层检查比较两种方法构建材料的成骨性能。结果:体外实验表明PRP组MSCs显示良好的增殖和成骨分化能力,明显优于对照组。体内实验表明PRP组修复大段骨缺损的能力显著优于对照组。结论:自体PRP具有良好的促成骨性能,可有效构建组织工程骨。
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bFGF基因转染对成骨细胞生物学行为的影响
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是调控成骨细胞增殖和分化的首选生长因子之一,而且还是一种强大的毛细血管增殖刺激剂。但外源性生长因子半衰期短,需反复给药,且价格昂贵[1,2]。我们将bFGF基因由体外转入兔骨膜源成骨细胞,观察了其对成骨细胞生物学的影响,报告如下。1.材料与方法:含有bFGF cDNA的克隆载体puc13-rbFGF由日本Inawashiro博士惠赠,用EcoR I酶切puc13-rbFGF及真核表达载体pcDNA3,用T4DNA连接酶连接后构建pcDNA3-bFGF重组表达质粒并鉴定。无菌条件下取2个月龄新西兰兔之双侧股骨和胫骨骨膜,37℃下用0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶各消化30min及2 h,将分离细胞接种于50ml培养瓶,加入含15%胎牛血清、10-7 M地塞米松、50mg/L维生素C、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基,在37℃5%CO2培养箱培养,用钙钴法行碱性磷酸酶(ALP)染色对培养细胞进行鉴定。
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人口腔粘膜上皮角朊细胞的体外培养
人口腔粘膜上皮角朊细胞的原代培养有许多困难,其中主要是上皮细胞接种成活率、产量和成纤维细胞污染的问题。我们比较酶消化法和组织块法建立口腔粘膜上皮角朊细胞体外培养模型,并用免疫组织化学法进行培养细胞的定性研究。 1.材料:培养物来源于5个月~10岁唇裂患者修复术中的口内粘膜。切取唇内侧粘膜组织修复剩余物若干,每块约0.5 cm×0.5 cm大小。 2.方法:①酶消化法:用D-Hanks液冲洗粘膜块,剪切至0.2 cm×0.2 cm大小。配制0.3 kg/LⅠ型胶原酶和0.4% Dispase消化液的混合液(1∶1)5 ml,将粘膜块放入其中,密闭放入4℃冰箱内12~20 h。将表皮从基底撕脱,放入5 ml 0.25%胰蛋白酶液中吹打5 min,终止消化。低速离心5 min,去上清,加入5 ml含15% 胎牛血清的基础培养液中,制成细胞悬液并调整细胞数目在5×108/L,接种于25 ml培养瓶中。②组织块法:将肉眼可见的粘膜下组织尽量去除。剪切至0.1 cm×0.1 cm大小,用探针将小组织块以0.5 cm的间距放于25 ml培养瓶内用多聚赖氨酸处理过的小盖片。轻轻翻转,放入37℃温箱2~4 h,加入2 ml含15%胎牛血清的基础培养液,轻轻翻转培养瓶,使培养液浸没组织块,静置培养,每周换液2次。
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转化生长因子β对白细胞介素1β诱导髁突软骨细胞凋亡的调控作用
关节软骨进行性破坏是骨关节炎(osteoarthoritis,OA)的主要病理改变之一.近来发现OA关节软骨有异常的软骨细胞凋亡,这可能与OA关节软骨的破坏有关.我们就TGF-β在人重组白细胞介素-1β(rhIL-1β)诱导髁突软骨细胞凋亡中的作用进行了研究.1.材料和方法:(1)rhIL-1β诱导软骨细胞凋亡:将髁突软骨细胞接种于培养瓶中,密度为3×104/ml,培养至对数生长期,实验组分别加入含有rhIL-1β(1、10、20 ng/ml)及二甲基亚砜(DMS0,15μl/ml)的DMEM培养液,处理8、16、24 h后收集细胞.分别用流式细胞仪、透射电镜、DNA电泳检测细胞凋亡.对照组不加rhIL-1β.
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骨组织工程的研究
“组织工程学”这个名称是1987年被正式提出的,早的定义是:“应用工程学和生命科学的原理和方法,认识哺乳动物正常和病理组织中结构-功能关系,并开发生物代用品,以恢复、维持或改善组织的形态和功能”。随着组织工程学研究的深入和发展,其内涵不断扩大。近年来,有人将生物材料诱导细胞分化、组织再生亦归于组织工程学范围,其定义也将会有所更改。组织工程的基本做法是,取少量自体组织,在体外分离、培养细胞,将一定量的培养细胞接种到具有一定空间结构的三维支架材料上,再将此细胞-支架复合物在体外继续培养,并植入体内培养,通过细胞生长繁殖、相互贴附、分泌细胞外基质,形成具有一定结构和功能的组织或器官。 1.骨的组织工程:骨组织工程是继软骨组织之后研究得较早、较多的对象。Vacanti(1993年)等将小牛骨膜细胞种植于多层编织的聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)支架中,然后移植于裸鼠体内,结果证实骨细胞可以增殖成为骨骼;Crane等[1]全面提出了骨组织工程研究的概念、方法、现状和前景,引起了广大学者的关注。近年来骨组织工程研究进展主要有两个方面:一是骨组织诱导;二是细胞传输[2]。和其他组织的组织工程研究原理和方法一样,组织工程骨的研究主要也是集中在种子细胞、支架材料和骨的构建3个方面。
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神经干细胞骨架和伴随结构
两篇关于永久神经先驱细胞的报告讨论了这种细胞接种在一种生物可降解的聚合物骨架或直接注入受损的脑部,就可修复因中风和帕金森氏症引起的脑损伤.
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温阳散结中药对裸鼠移植性肝癌生长及微血管密度的影响
本实验将传代的人BEL-7402肝癌细胞接种于裸鼠腋下,观察温阳散结中药不同浓度及不同给药途径对裸鼠肿瘤生长影响.并采用免疫组织化学染色方法,对肿瘤间质内微血管标记后定量计数,探讨中医药在抑制肝癌微血管方面的作用.
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乳腺癌与血管生成
血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成的新的血管.血管生成的基本过程包括血管内皮细胞(EC)的激活,细胞外基质(ECM)的降解,EC的移行、增殖,管腔结构形成以及血管外膜的形成[1].在正常人,促血管生成因子和血管生成抑制因子处于平衡状态.近30年来,大量研究结果证实:乳腺癌的肿瘤细胞接种到动物体内后,具有明显的促血管生成活性,乳腺癌的生长、代谢及转移需要持续的血管生长.其主要通过灌注作用、转移作用、相互旁分泌效应促进乳腺癌的生长、进展和转移[2].
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HCCR mRNA在急性白血病患者中的表达及其临床意义
人类子宫颈癌基因(HCCR)是新近确认的一种致癌基因,早由韩国学者Ko等[1]通过差异显示RT-PCR方法从子宫颈癌细胞中筛选、鉴定而出.HCCR基因定位于人染色体12q,分为2个亚型,分别为HCCR1(基因库登记号AF195651)和HCCR2(基因库登记号AF315598).HCCR1和HCCR2编码序列具有高度同源性,为同一mRNA的不同剪切体.研究表明,将表达HCCR1或HCCR2的细胞接种到裸鼠体内可以形成肿瘤,HCCR基因导致肿瘤的发生可能是通过对p53抑癌基因的负向调控而实现的.
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组织工程化关节软骨的研究进展
20世纪80年代以来, 组织工程学的出现及发展为解决关节软骨缺损、重建关节功能提供了新思路, 使软骨组织缺损的完全再生成为可能.软骨组织工程是当前组织工程研究的热点之一,它的基本方法是将体外分离培养的正常组织细胞接种到具有一定空间结构和良好的生物相容性的三维支架上, 然后将细胞-支架复合物在体外继续培养或植入体内, 同时辅以特殊的生长因子, 支架材料逐渐降解, 为细胞分泌的基质所代替,形成组织或器官的结构, 并行使功能,现将其研究进展综述如下.
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组织工程心脏:电生理特性及长期安全性?
背景:由于供体心脏严重短缺并受制于伦理道德,很多需要心脏移植的患者终因缺乏供体心脏而死亡.理论上组织工程心脏是解决供体心脏不足的重要手段.目的:回顾分析组织工程心脏构建用的支架材料、种子细胞及细胞接种培养方法,为后期组织工程心脏的构建做参考.方法:由作者检索2004年至2016年PubMed数据库及SCI(web of science)数据库关于组织工程心脏构建方法研究的文献,共检索文献2921篇,按照纳入和排除标准进行筛选,共纳入53篇.结果与结论:器官的体外培养及组织工程心脏功能是组织工程心脏构建的难点.组织工程心脏体外培养需要提供心肌细胞增殖需要的营养、气体、温度及相应的电刺激.心肌细胞的诱导、支架材料的获取及体外培养系统的建立是组织工程心脏构建过程中不可缺少的条件.优化支架材料的脱细胞流程,整合理想的种子细胞并提高其在支架内的黏附、增殖和分化能力,通过基因调控改善组织工程心脏的电生理特性,长期的安全性分析等,每一项研究目标都任重而道远.
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天然珊瑚做为成骨细胞接种支架的可行性观察
目的通过观察培养成骨细胞 ( Osteoblasts,OBs) 在天然珊瑚 ( Natural Coral, NC) 表面的生长情况来评价其作为骨组织工程支架材料的可行性 . 方法将 NC 处理后 , 用扫描电镜 ( Scanning Electronic Microscope, SEM) 观察其立体结构 , 并测定孔径和孔隙率 . 分离、培养兔颅骨 OBs, 将细胞按 5× 106个 /ml浓度接种于 NC中 , 通过倒置显微镜、 SEM观察 OBs在 NC表面的贴附、伸展情况 , 并测定细胞在 NC表面生长时的碱性磷酸酶 ( ALP) 活性 . 结果 NC中含有三维交通的孔隙 , 其孔率约为 36% , OBs接种后 1 d, 即可在 NC表面贴附并伸展 , 5 d后可长满珊瑚表面 , 并保持其 ALP活性 . 结论珊瑚对 OBs具有良好的相容性 , 并具有多孔性 , 适于作为 OBs接种的支架而用于骨的组织工程 .
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采用生物反应器体外构建大面积组织的接种技术
目的 采用培养袋生物反应器进行大面积支架材料细胞接种技术的研究.方法 以人体成纤维细胞和PET无纺布支架材料为模型,考察水平摇床的转速和起始细胞悬液密度对细胞接种动力学、细胞接种率、支架中细胞密度以及细胞分布的影响.结果 在实验条件范围内,成纤维细胞接种大面积PET支架材料的过程基本符合一级反应动力学;低细胞悬液密度接种时,接种率和支架中细胞密度随转速的增加而下降,高细胞悬液密度接种时则反之;细胞分布均匀度都随着转速的增加而下降,起始细胞悬液密度对细胞分布影响较小.结论 采用培养袋生物反应器进行大面积支架材料的细胞接种是可行的,研究结果 为进一步优化适合大面积支架材料接种的方法 奠定基础.
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肝脏组织工程种子细胞来源研究进展
组织工程学是应用工程学和生命科学的原理与方法,研究机体的组织结构与功能的关系,并开发生物代用品,以恢复、维持或改善组织的形态和功能的一门新兴学科.其基本的研究方法包括:分离某种细胞在体外进行培养扩增后,将高浓度、有活力的种子细胞接种于生物相容性良好、具有预制形态和空间结构、并可生物降解的合成聚合物或天然的细胞载体中,再植入体内或缺损部位,在生物材料逐步降解吸收的过程中,种子细胞继续增生繁殖、分泌细胞外基质,形成新的具有特殊功能和形态的相应组织或器官,达到修复缺损和功能重建的目的.
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B16小鼠皮肤恶性黑素瘤模型的建立
恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是由皮肤和其他器官的黑素细胞系统所发生的一种恶性程度相当高的肿瘤,容易发生血行转移.黑素瘤B16是C57BL/6小鼠耳根部皮肤的自发性肿瘤.近我们将B16细胞接种于同基因小鼠皮下,初步建立了较理想的皮肤恶性黑素瘤动物模型[1,2],为下一步实验做准备.