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长梗秦艽酮通过调节Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL-7402细胞生长
目的:研究长梗秦艽酮抑制人肝癌BEL-7402细胞生长与Akt和ERK1/2通路的关系.方法:采用MTT法观察BEL-7402细胞活性,Western blot蛋白质印记法检测Akt和ERK1/2磷酸化水平,流式细胞术分析细胞周期.结果:长梗秦艽酮能够抑制人肝癌BEL-7402细胞生长,诱导S期细胞周期阻滞,激活Akt和ERK1/2磷酸化,并凡Akt和ERK1/2抑制剂能够拮抗长梗秦艽酮对BEL-7402细胞的生长抑制和S期阻滞诱导作用.结论:长梗秦艽酮可以通过调节Akt和ERK1/2通路诱导肿瘤细胞周期阻滞,从而抑制肿瘤细胞生长.
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人肝癌细胞冷冻保存方法研究
有关利用普通冰箱-18℃冷冻保存组织及细胞,迄今未见报道[1-4].本实验对-18℃冷冻保存人肝癌细胞株Bel-7402进行实验研究,现报告如下:
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甘露糖受体在肝细胞癌中的表达及意义
目的:观察甘露糖受体(mannose receptor, MR)在肝细胞癌组织/肝癌细胞系中的表达,探讨其与肝细胞癌发生、发展及恶性程度的关系.方法:应用免疫组织化学检测50例肝细胞癌组织及癌旁组织、10例正常肝组织中MR的表达,免疫荧光法、Western blot法检测肝癌细胞系、肝细胞系中MR的表达.结果:免疫组织化学染色:肝细胞癌组织中MR的表达水平明显高于癌旁组织及正常肝组织(86％ vs 76％,30％,P＜0.05).免疫荧光:MR在肝癌细胞系BEL-7402、HepG2和人肝细胞系HL-7702中均有表达.在肝癌细胞系BEL-7402、HepG2上有很强的MR表达,在肝细胞系HL-7702上MR的表达分布明显较少.Westem blot法:MR在肝癌细胞系HepG2、BEL-7402和人肝细胞系HL-7702上均有表达,肝癌细胞BEL-7402中MR的表达水平明显高于肝癌细胞HepG2(P＜0.01)、肝细胞HL-7702(P＜0.01).结论:MR在肝细胞癌组织/肝癌细胞系中高表达提示可能与肝细胞癌的发生、发展及恶性程度密切相关.
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黄芩苷逆转人肝癌细胞耐药株Bel-7402/ADM多药耐药性的相关机制研究
目的 考察黄芩苷对人肝癌耐药细胞Bel-7402/ADM 多药耐药性的逆转机制.方法 MTT法考察Baicalin对人肝癌多药耐药细胞的逆转作用.结果 Baicalin逆转Bel-7402/ADM多药耐药性的机制可能与抑制MDR1部分基因产物P-gp、MRP、GSH/GST的表达和诱导细胞凋亡有关.结论 Baicalin可能通过抑制MDR1部分基因产物P-gp、MRP、GSH/GST的表达和诱导细胞凋亡逆转Bel-7402/ADM的多药耐药性.
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美洲大蠊多肽对人肝癌细胞Bel-7402裸鼠移植瘤生长的抑制作用
目的:探讨美洲大蠊多肽对裸鼠人肝细胞Bel-7402移植瘤生长及血管生成的抑制作用.方法:建立裸鼠人肝癌细胞株Bel-7402移植瘤模型,观察美洲大蠊多肽对肿瘤生长、微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.结果:美洲大蠊多肽不同程度抑制裸鼠移植瘤的生长,各治疗组给药后肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率明显下降,与对照组比较,P ＜0.05;美洲大蠊多肽治疗组微血管分布较稀疏,MVD值由对照组的(64.77±13.49)分别降低到(41.52±5.36),(35.56±5.12)和(30.28±4.17),差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).美洲大蠊多肽治疗组能明显减少VEGF的阳性表达,阳性表达率由对照组的(75.35±13.89)％减少到(59.77±12.07)％,(42.19±11.57)％和(35.88±10.26)％,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论:美洲大蠊多肽能明显抑制Bel-7402裸鼠移植瘤的生长,降低肿瘤MVD,减少瘤组织中VEGF的表达,揭示其抗肿瘤作用与抑制血管生成有关.
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氧化吲哚类化合物Z24的体内抑瘤活性及其血管生成抑制作用
目的从抗血管生成活性的角度,寻找新的抗肿瘤药物,研究Z24的体内抑瘤活性及其对血管内皮细胞的选择性抑制作用.方法 MTT法检测不同浓度的Z24作用72 h时对人肝癌细胞系BEL-7402及正常人胚肺二倍体细胞2BS的生长抑制作用,并从浓度-抑制率曲线求出IC50;台盼蓝拒染计数法检测不同浓度的Z24作用72 h时对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长抑制作用,从浓度-抑制率曲线求出IC50;小鼠S180, H22和裸小鼠皮下移植性人肝癌BEL-7402模型研究Z24的体内抑瘤作用.鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成模型检测Z24的血管生成抑制活性.结果 MTT法测得Z24对BEL-7402生长抑制作用的IC50为106 μmol*L-1,对2BS生长抑制作用的IC50为116 μmol*L-1.台盼蓝拒染计数法测得Z24对HUVEC生长抑制作用的IC50为6.44 μmol*L-1.Z24可明显抑制鸡CAM新生血管的形成Z24 100 mg*kg-1可使S180, H22和裸小鼠人肝癌BEL-7402模型的肿瘤重量较对照组分别下降52.5%(n=10, P<0.01), 41.5%(n=10, P<0.01)和53.4%(n=6, P<0.01).Z24可显著抑制CAM的血管生成.结论 Z24对多种肿瘤动物模型均具有显著的体内抑瘤活性,对血管内皮细胞有选择性抑制作用, 并明显抑制CAM新生血管的生成.
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温阳散结中药对裸鼠移植性肝癌生长及微血管密度的影响
本实验将传代的人BEL-7402肝癌细胞接种于裸鼠腋下,观察温阳散结中药不同浓度及不同给药途径对裸鼠肿瘤生长影响.并采用免疫组织化学染色方法,对肿瘤间质内微血管标记后定量计数,探讨中医药在抑制肝癌微血管方面的作用.
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姬松茸多糖诱导Bel-7402细胞凋亡的实验研究
目的研究姬松茸多糖(PAB)对人肝癌细胞Bel-7402凋亡的影响及其机制.方法用不同浓度的PAB与小鼠脾淋巴细胞共同培养制备上清;应用流式细胞术分析各组Bel-7402细胞凋亡情况、细胞内p53蛋白的表达以及肿瘤细胞内Ca2+水平的变化;应用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化;应用荧光显微镜观察细胞内p53蛋白表达的变化.结果与阴性对照组相比较,通过流式细胞仪检测,治疗组细胞凋亡率和细胞内Ca2+ 水平显著升高(P<0.01);通过流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内p53蛋白的表达无显著差异,透射电子显微镜观察显示出细胞凋亡的典型形态学变化.结论 PAB具有诱导Bel-7402细胞凋亡的作用.
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树突状细胞联合LPAK细胞体外诱导肝癌细胞株凋亡的形态学研究
目的研究人外周血树突状细胞(Dendritic Cell，DC)联合LPAK细胞体外诱导人肝癌细胞株BEL-7402凋亡的作用，并进行形态学分析。方法实验分LD、L、D和B四组，采用中性红摄入比色法检测细胞毒活性，原位末端标记(TUNEL)技术、电镜技术观察细胞的光镜形态和超微结构。结果 D组与B组比较吸光度值无显著性差异，即无杀伤活性(P>0.05)；LD组与L组比较，细胞毒活性为LD组>L组(P<0.01)。光镜下凋亡的肿瘤细胞呈TUNEL阳性，细胞核染成棕黄色或深棕色，大小不等，形态也不一；电镜下肿瘤细胞核染色质凝聚、固缩和胞质浓缩，凋亡小体多见；少部分LPAK细胞内形成自噬体，发生自噬性凋亡。结论人血DC联合LPAK细胞能有效地诱导肝癌细胞凋亡，在此过程中LPAK细胞同时发生自噬性凋亡。
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温化胶囊对人肝癌细胞株Bel－7402凋亡的作用
目的：研究温化胶囊对Bel－7402人肝癌细胞株凋亡的影响。方法对人肝癌细胞株Bel－7402进行体外细胞培养，分设阴性对照组、低剂量温化胶囊组（150μg/mL）及高剂量温化胶囊组（750μg/mL），每组设置5个平行实验。使用流式细胞仪分析温化胶囊对人肝癌细胞株Bel－7402凋亡的影响。结果与阴性对照组相比较，高剂量温化胶囊组能够提高Bel－7402细胞的凋亡率[（9．620±0．593）%vs （5．520±1．270）%]，差异有统计学意义（P<0．05）。同时，高剂量温化胶囊组与阴性对照组相比，S期细胞比例[（31．92±2．19）%vs （24．90±1．16）%]增加（P<0．05）。结论温化胶囊具有诱导Bel－7402人肝癌细胞株凋亡的作用并引起细胞周期的改变。
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白头翁皂苷D联合索拉非尼对人肝癌细胞转移的影响
目的：探讨白头翁皂苷D联合索拉非尼对人肝癌细胞株转移的影响。方法人肝癌细胞株BEL-7402细胞按干预方式不同分为白头翁皂苷D组（11.9 mg/L）、索拉非尼组（2.15μmol/L）、联合组（白头翁皂苷D 11.9 mg/L+索拉非尼2.15μmol/L）以及对照组（普通培养液）。通过MTT法、Transwell小室实验、细胞划痕实验观察白头翁皂苷D和索拉非尼单药和联合对BEL-7402细胞迁移的抑制作用，并用Western blot检测基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表达的影响。结果 MTT结果显示，白头翁皂苷D、索拉非尼单药和联合对BEL-7402细胞的增殖均有抑制作用，且24 h的抑制率均<15%；Transwell小室实验和细胞划痕实验结果显示，联合组的迁移抑制率高于单药组（P<0.01），联合作用为相加（0.85≤联合效应≤1.15）；Western blot检测示联合组在下调MMP-2、MMP-9方面的作用强于单药组（P<0.05）。结论白头翁皂苷D和索拉非尼联合可协同抑制BEL-7402细胞转移，联合效果整体优于单药。
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华蟾素对人肝癌细胞Bel-7402细胞增殖及周期的影响
目的:观察华蟾素注射液对人肝癌Bel-7402细胞增殖及周期的影响.方法:将不同浓度的华蟾素注射液作用于Bel-7402细胞,应用噻唑蓝还原法(MTT比色法)检测华蟾素注射液对Bel-7402细胞增殖的影响；应用流式细胞术(FCM)检测Bel-7402细胞周期分布.结果:华蟾素注射液可以抑制Bel-7402细胞增殖,其抑制作用与作用时间和剂量呈正相关,并可使细胞阻滞于G2/M期.结论:华蟾素注射液能够抑制人肝癌细胞Bel-7402的增殖,并可使细胞阻滞于G2/M期,诱导细胞凋亡.
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双特异性重组腺病毒Ad-HT对肝癌细胞的体内、外抑制效应
目的:探讨双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad-HT对肝癌细胞的体内、外抑制作用和作用方式.方法:运用噻唑兰法检测重组腺病毒Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用;应用AO/EB染色法、DAPI染色法、Annexin V检测、Caspase检测、线粒体膜电位检测和活性氧检测等多种方法分析Ad-HT对BEL-7402细胞抑制作用的方式和途径;构建C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,瘤内注射重组腺病毒,通过非放射性乳酸脱氢酶细胞毒性检测方法,检测NK活性、CTL活性,利用酶联免疫吸附方法检测IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等细胞因子水平,探讨Ad-HT对体内实体肿瘤的抑制作用和对免疫系统的影响.结果:Ad-HT能够抑制BEL-7402细胞生长,且其作用具有一定时效和剂效关系趋势;Ad-HT感染导致BEL-7402细胞磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加、Caspase酶活性增强、线粒体膜电位下降和活性氧水平升高;Ad-HT实验组模型动物平均期在30天以上,显著高于对照组;另外,Ad-HT具有增强NK和CTL活性,上调IL-2和IFN-γ等细胞因子水平的功能.结论:Ad-HT能够通过诱导细胞凋亡,抑制BEL-7402肿瘤细胞增殖,而这种抑制作用可能通过线粒体途径实现.另外,Ad-HT能够有效延长模型动物平均生存期,活化免疫功能细胞,并使免疫趋向Th1优势.
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Survivin-2B增强甲氨蝶呤抑制BEL-7402
目的:研究高表达Survivin-2B对化疗药物甲氨蝶呤抑制肝肿瘤细胞株BEL-7402作用的影响.方法:构建真核表达重组质粒Survivin-2B/pcDNA3.1(-),利用增强型绿色荧光蛋白pEGFP-C1真核质粒测定脂质体转染条件及效率,采用该条件瞬时转染Survivin-2B/pcDNA3.1(-)、Survivin/pcDNA3.1(-)以及pcDNA3.1(-)阴性对照质粒至肝肿瘤细胞株Bel-7402,MTT法检测100mg/ml甲氨蝶呤作用时,各组细胞抑制情况的差异.结果:成功构建Survivin-2B/pcDNA3.1(-)重组质粒,脂质体转染48h转染效率为62％,甲氨蝶呤对高表达Survivin-2B的Bel-7402细胞抑制率高.结论:Survivin-2B与甲氨蝶呤同时作用可以提高对Bel-7402细胞的抑制率,为肿瘤治疗提供了新思路.
关键词： 剪接体 Survivin-2B survivin BEL-7402 -
白花蛇舌草豆甾醇对肝癌细胞的体内外抑制作用及对其增殖周期、凋亡的影响
目的:研究白花蛇舌草豆甾醇(stigmasterol from Hedyotis diffusa willd.,SHD)对人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402的体外抑制作用,对肝癌H22的体内抑制作用及对其增殖周期、凋亡的影响.方法:MTT法评价SHD对人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402的抑制率变化规律.昆明雄性小鼠60只,随机取10只为正常对照组,余接种H22瘤株,随机分为模型对照组、5-FU阳性对照组(30mg/kg)和高中低剂量SHD给药组(剂量分别为15、30、60mg/kg),腹腔给药10 d后,比较各组瘤重抑制率、H22细胞周期分布、凋亡率.结果:SHD对SMMC-7721、BEL-7402细胞具有体外抑制作用;SHD显著抑制H22肿瘤,增加GO-G1期细胞比例,降低G2/M期细胞比例,促进肿瘤细胞凋亡.结论:SHD在体外、体内均具有抑制肝癌细胞的作用,此作用与阻滞肿瘤细胞增殖周期,促进肿瘤细胞凋亡有关.
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抗CD28单抗对T细胞体外抗瘤作用的影响
采用健康人外周血T淋巴细胞分别与BEL-7402人肝癌细胞和抗CD28混合培养,检测淋巴细胞活化增殖能力、CTL细胞的杀伤活性、培养上清IFN-γ和TNF-α的水平.结果发现,在BEL-7402刺激细胞存在时,抗CD28促进增殖的佳浓度为6 μg/ml,而单一抗CD28不能刺激T细胞增殖.BEL-7402细胞和抗CD28共刺激后IFN-γ和TNF-α分泌均比单纯BEL-7402高,同时其诱生的CTL细胞杀伤BEL-7402的能力也强于对照组,其差异均具有显著性(P＜0.01).上述结果提示,抗CD28单抗共刺激诱导CD4+和CD8+T细胞参与抗肿瘤免疫,使IFN-γ、TNF;-α的分泌增多,增强了体外T细胞抗瘤作用.
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人肝癌细胞中缺氧反应元件对微环境的反应
目的:通过观察缺氧反应元件(hypoxia-response element,HRE)调控下,绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein,GFP)构建的肝癌细胞Bel-7402/5HRE-EGFP在缺氧条件下,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等表达水平的变化,研究HRE对微环境的反应特性.方法:以5个串连的HRE和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)的微小启动子为转录调控元件、GFP为报告基因构建表达载体,应用FCM和细胞免疫染色法观察缺氧、一氧化氮、过氧化物和酸性pH等微环境的变化对人肝癌细胞Bel-7402中HRE活性的影响,以及缺氧条件下HIF-1α、VEGF表达水平的变化.观察缺氧探针哌莫硝唑的染色强度和分布与HIF-1α、VEGF和GFP表达强度和分布之间的关系,探求裸鼠体内肿瘤组织缺氧对HRE活性及其相关基因表达的影响.结果:肝癌细胞中HRE对缺氧非常敏感,肿瘤细胞和组织缺氧时可上调HIF-1α和VEGF的表达,两者的分布也基本一致.结论:缺氧在调控肝癌血管生成因子表达方面可能起着重要的作用.
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稳定表达细胞色素P4501A1人肝癌细胞系的建立
目的:建立稳定表达人细胞色素P4501A1(CYP1A1)的人肝癌细胞系(Bel-7402).方法:通过将人细胞色素P4501A1(CYP1A1)的表达质粒转染到人肝癌细胞系(Bel-7402),经G418抗性筛选得到稳定的克隆并扩大培养成系,Western Blotting检测蛋白的表达.细胞增殖试验鉴定CYP1A1的多环芳烃类底物二甲基苯并蒽(DMBA)对Bel-7402/1A1细胞的增殖抑制作用.双核微核实验对Bel-7402/1A1细胞进行了遗传毒理的短期实验.结果:转染后筛选得到的Bel-7402抗性克隆,Western Blotting检测表明有较高的CYP1A1蛋白表达.细胞暴露于DMBA时,Bel-7402/1A1与Bel-7402细胞相比,细胞增殖明显抑制.双核微核试验表明Bel-7402/1A1细胞的微核率随DMBA浓度增高而显著增加,Bel-7402无明显变化.连续传代后仍有CYP1A1标志酶EROD的较高表达,该酶活性能被CYP1A1抑制剂α-萘黄酮抑制.结论:建立了一个新的稳定表达CYP1A1的1个肝癌细胞系(Bel-7402/CYP1A1),可代谢多环芳烃化合物产生更大的毒性.该细胞系可用来筛选能被CYP1A1代谢的化合物,或能抑制CYP1A1活性的化合物,并可用来研究CYP1A1的催化性质及被CYP1A1代谢的化合物的毒性机理.
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七叶皂苷钠体外抑制Bel-7402细胞增殖
目的 探讨七叶皂苷钠体外抑制Bel-7402细胞增殖中的作用.方法 将Bel-7402细胞分对照组和不同浓度七叶皂苷钠组,用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双标检测细胞凋亡,Western blot法检测p21和p53蛋白表达.观察各组细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的变化;观察各组p21和p53蛋白表达的变化.结果 七叶皂苷钠能抑制Bel-7402细胞的增殖,呈时间和浓度依赖性.当七叶皂苷钠浓度为40μg/ml和60μg/ml时,作用48h后,细胞周期被阻滞在G0/G1期,凋亡率高于对照组(P＜0.05);p21和p53蛋白表达水平升高.结论 七叶皂苷钠可能通过上调p21和p53蛋白水平诱导Beb7402细胞凋亡.
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上调miR-320a对注射用核糖核酸Ⅱ诱导的肝癌Bel-7402细胞凋亡和迁移的影响
目的 研究上调miR-320a对注射用核糖核酸Ⅱ(BP素)诱导的肝癌Bel-7402细胞凋亡和迁移的影响.方法 用定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-320a在正常肝细胞与肝癌细胞中的表达差异;将miR-320a mimic转染到Bel-7402细胞中,qRT-PCR法检测miR-320a的表达水平;CCK-8法检测注射用核糖核酸Ⅱ对肝癌细胞增殖的影响;FCM检测细胞周期分布及凋亡变化;Transwell法检测注射用核糖核酸Ⅱ对肝癌细胞迁移和侵袭的影响;Western blot检测细胞周期蛋白D1的表达及凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2,迁移相关蛋白MMP-3的表达.结果 与正常肝细胞相比,miR-320a的表达水平在肝癌细胞中明显下调.转染miR-320a mimic的Bel-7402细胞命名为Bel-7402-miR-320a,CCK-8结果显示,给予注射用核糖核酸Ⅱ(l00、200、300、400、500 mg·L-1)后,Bel-7402及Bel-7402-miR-320a细胞的增殖均受到了抑制.在Bel-7402和BelG402-miR-320a中,12h半数抑制浓度为250、200 mg·L-1,24 h半数抑制浓度为150、120 mg·L-1.FCM检测结果显示,注射用核糖核酸Ⅱ可诱导Bel-7402、Bel-7402-miR-320a细胞周期阻滞在G0/G1期,上调miR-320a后细胞凋亡率明显增加.Transwell结果显示,与Control组和加药组相比,Bel-7402-miR-320a+ Ribonucleic acidⅡ组细胞迁移和侵袭明显受到抑制.Western blot结果显示,注射用核糖核酸Ⅱ作用Bel-7402和Bel-7402-miR-320a细胞后,凋亡相关蛋白p53、Bax的表达增加,而Cyclin D1、Bcl-2、MMP-3蛋白的表达下调.结论 miR-320a在肝癌Bel-7402细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞.注射用核糖核酸Ⅱ可以通过下调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,将细胞周期阻滞在G0/G1期,激活p53信号通路,下调Bcl-2、上调Bax,破坏Bcl-2/Bax的比例,促进入肝癌Bel-7402细胞的凋亡,并通过抑制MMP-3的表达抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭.而过表达miR-320a后,可提高肝癌细胞对注射用核糖核酸Ⅱ的敏感性,增强注射用核糖核酸Ⅱ对肝癌细胞Bel-7402的作用.
