组织块法培养微血管内皮细胞的实验研究

不同体外方法培养兔角膜缘上皮细胞作用的研究

自从1986年Schermer等[1]发现角膜缘干细胞位于角膜缘基底Vogt栅栏内后,对角膜缘干细胞缺失和角膜上皮病变治疗有了许多新的疗法,其中以角膜缘上皮细胞体外培养法治疗上述疾病比较有效.目前,多数学者采用组织块法进行角膜缘上皮细胞体外培养,但在培养系中干细胞能否从组织块中迁移出来尚有争议.

人口腔粘膜上皮角朊细胞的体外培养

人口腔粘膜上皮角朊细胞的原代培养有许多困难，其中主要是上皮细胞接种成活率、产量和成纤维细胞污染的问题。我们比较酶消化法和组织块法建立口腔粘膜上皮角朊细胞体外培养模型，并用免疫组织化学法进行培养细胞的定性研究。 1．材料：培养物来源于5个月～10岁唇裂患者修复术中的口内粘膜。切取唇内侧粘膜组织修复剩余物若干，每块约0.5 cm×0.5 cm大小。 2．方法：①酶消化法：用D-Hanks液冲洗粘膜块，剪切至0.2 cm×0.2 cm大小。配制0.3 kg/LⅠ型胶原酶和0.4% Dispase消化液的混合液（1∶1）5 ml，将粘膜块放入其中，密闭放入4℃冰箱内12～20 h。将表皮从基底撕脱，放入5 ml 0.25%胰蛋白酶液中吹打5 min，终止消化。低速离心5 min，去上清，加入5 ml含15% 胎牛血清的基础培养液中，制成细胞悬液并调整细胞数目在5×108/L，接种于25 ml培养瓶中。②组织块法：将肉眼可见的粘膜下组织尽量去除。剪切至0.1 cm×0.1 cm大小，用探针将小组织块以0.5 cm的间距放于25 ml培养瓶内用多聚赖氨酸处理过的小盖片。轻轻翻转，放入37℃温箱2～4 h，加入2 ml含15%胎牛血清的基础培养液，轻轻翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，静置培养，每周换液2次。

不同培养方法对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的 探讨酶消化法和组织块法是否影响牙周膜细胞的特性.方法 培养牙周膜细胞,检测克隆形成能力及细胞周期分析,Stro-1的表达,实时定量RT-PCR检测.结果 酶消化法培养的PDLCs+G2M明显高于组织块法的PDLC;酶消化法培养的PDLC克隆形式能力明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC Stro-1的表达明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC成骨标志物的表达明显高于组织块法培养的PDLC.酶消化法培养的牙周膜细胞具有更强的增殖能力和间充质干细胞含量更多,成骨标志物表达更强.结论 酶消化法和组织块法影响牙周膜细胞的某些特性.

酶消化组织块盖玻片培养法原代培养人牙周膜细胞

人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDL)是牙周组织中重要的细胞成分,其可产生胶原纤维,能合成胶原并释放到胞外基质,对牙体组织有着重要作用.基于牙周膜细胞的重要角色, 广大学者对HPDL 的研究数不胜数,而体外培养是研究HPDL 体外模型的一种主要方法,传统的细胞体外培养方法有酶消化法和组织块法.

三种方法原代培养人牙周膜细胞

背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础.牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一.如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一.目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法.方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线.结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%).3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好.第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期.提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法.

膀胱上皮细胞的体外原代培养方法

背景:国内外获得原代人正常膀胱上皮细胞的方法包括酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法,这些方法各有优缺点,培养基中成分多不易把握,效率不高.目的:分析人膀胱上皮细胞原代培养的佳方法.方法:在同一实验条件下,采用酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法3种不同的原代细胞培养方法培养人正常膀胱黏膜膀胱上皮细胞.结果与结论:酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法各组膀胱上皮细胞培养成功率分别为13.3%,26.7%,86.7%,3组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001).3组培养的人膀胱上皮细胞角蛋白AE1/AE3荧光染色均呈阳性.说明组织块培养法是一种简单,短期内可扩增出较多纯净的膀胱上皮细胞的原代培养方法.

组织块法培养成年兔肌腱细胞

背景:体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础.目的:采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达.方法:无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10~15 min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1 mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3 d换液1次,当细胞长到80%~90%融合时按1∶3传代.结果与结论:一般10 d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样.传代细胞刚接种时圆形,4~6 h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群.从传代细胞的生长曲线可看出,前4 d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7 d以后进入平台期.免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性.结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞.

人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养:组织块法的优化

背景:关于人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法的研究很多,但是如何简便、快捷获得大量原代培养间充质干细胞的问题尚未解决.目的:探讨优化人胎盘绒毛膜间充质干细胞体外分离培养组织块法的佳方法.方法:无菌条件下,取正常足月剖宫产胎盘绒毛膜,用匀浆器处理组织块,采用组织块法贴壁分离培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞,经初次培养的组织块进行再次接种培养.结果与结论:用电动匀浆器处理人胎盘绒毛膜省时省力,组织分散度和去除红细胞效果好.初次培养和再次培养获得细胞的平均时间分别为(17.73±1.14)d和(10.03±1.30)d.每个Φ100 mm培养皿获得的原代细胞分别为(6.97±0.98)×105个和(13.82±1.44)×105个.获得的贴壁细胞呈典型的成纤维细胞形态,呈平行或漩涡状生长,高表达CD90、CD73、CD105,而CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR为阴性.细胞可向成骨、成脂方向诱导分化.结果表明优化的方法能够简便、快捷地处理人胎盘绒毛膜组织,获得大量的原代间充质干细胞.

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞，成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大，不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法，探索一种操作简便，既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法，为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨，以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞，进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好，具备典型成骨细胞特性，细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多，细胞存活率高(P<0.05)；且比分段胶原酶消化法操作简单，耗时短。组织块法操作为简单，对细胞损伤较小，但是细胞数量低、耗时长，很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。

酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞

背景:获取高纯度、高活性的成骨细胞是进行骨代谢研究的基础.目的:探索一种简便、高效的原代成骨细胞培养方法.方法:将新生24 h内的SD大鼠,分离获取颅骨的顶骨和额骨,预先采取胰酶和胶原酶消化,再进行组织块培养的方法提取成骨细胞.通过倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态,细胞计数绘制细胞生长曲线,采用碱性磷酸酶BCIP/NBT染色和茜素红矿化结节染色进行成骨细胞鉴定.结果与结论:①细胞形态呈长梭形、三角形、不规则多边形,有两至三个细胞突起;②透射电镜下线粒体和内质网在成骨细胞中非常丰富,并且有较多细胞突起,呈现出典型成骨细胞特点;③细胞刚接种时生长缓慢,3 d后增殖加快,第7天达高峰;④碱性磷酸酶BCIP/NBT染色显著阳性,茜素红钙结节染色橘红色;⑤采用酶消化法联合组织块法提取的细胞具有典型的成骨细胞特征和功能,是一种理想的原代成骨细胞分离培养方法.

婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞观察:培养、鉴定及生长状况

背景:目前婴幼儿血管瘤的发病机制尚不明确,通过体外培养的血管瘤内皮细胞进行发病机制的研究为当前研究的热点.目的:探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性.方法:采用组织块贴壁法原代培养血管瘤内皮细胞,第Ⅷ因子相关抗原、CD31、CD34免疫组织化学SP法鉴定内皮细胞并测出内皮细胞纯度;观察血管瘤内皮细胞的生物学特性.结果与结论:成功培养出血管瘤内皮细胞,第Ⅷ因子相关抗原、CD31、CD34均为阳性.检测纯度:CD34(+)数为(68.35±3.58)％.细胞形态为较规则的圆形、椭圆形或多角形,呈现特有"铺路石"特征,而且还具有血管瘤内皮细胞特有的"管腔形成"现象.结果表明,组织块贴壁法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞,传代后第3,4代适于体外实验研究.

人脐带间充质干细胞生物特性比较：胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景：以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的：比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。
　　方法：采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞，记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期，倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况，制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线，流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达，第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。
　　结果与结论：使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞，胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P <0.05)；原代培养周期差异无显著性意义(P >0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长，形态为成纤维细胞样，但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形，不规则，细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法，在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P<0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型，均表达CD29，CD105，不表达CD34，CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后，免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞，但组织块法更适合于此类细胞的培养，对细胞的伤害更低。

原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究

背景：如何获得大量稳定活力好的细胞是人脐带间充质干细胞培养的难点。
　　目的：通过组织块法、酶消化法和酶解组织块法3种细胞培养方法比较，筛选出佳的人脐带间充质干细胞的培养方式。
　　方法：分离新鲜脐带10根，分别采用组织块法、酶消化法、酶解组织块法3种方式培养人脐带间充质干细胞，比较3种方式原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间、细胞培养成功率、绘制细胞增殖曲线，利用流式细胞仪检测细胞表面标志，并进行多项分化能力检测。
　　结果与结论：酶解组织块培养法原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间与酶消化法无显著差异，但明显短于组织块法(P <0.01)，原代人脐带间充质干细胞培养成功率显著高于其他两组，人脐带间充质干细胞增殖情况3组无显著性差异，酶解组织块培养法培养的第3代人脐带间充质干细胞其细胞表面标志及多项分化能力符合间充质干细胞的特性。酶解组织块培养法能缩短原代人脐带间充质干细胞爬出时间，显著提高原代人脐带间充质干细胞的成功率。

细胞因子抑制剂吡非尼酮对体外培养人瘢痕成纤维细胞增殖的影响

背景：有研究表明细胞因子抑制剂吡非尼酮通过调控多种细胞因子，抑制成纤维细胞的生物学活性，其在内脏器官的抗纤维化作用的研究和应用取得了良好的进展，但对于皮肤增生性瘢痕及成纤维细胞是否有影响及其机制尚不清楚。目的：观察细胞因子抑制剂吡非尼酮对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法：采用组织块法培养人增生性瘢痕成纤维细胞，实验取第3-6代生长状态良好的对数生长期细胞。根据吡非尼酮不同质量浓度分为对照组(吡非尼酮0 g/L)，吡非尼酮0.15，0.3，1 g/L组，共干预12，36，48 h。结果与结论：MTT，反转录-聚合酶链式反应和酶链免疫吸附实验结果显示，与对照组相比，吡非尼酮0.15，0.3，1 g/L组细胞增殖情况、转化生长因子β1 mRNA的表达、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分泌量均降低(P<0.05)，其中吡非尼酮1 g/L组降低明显(P <0.05)。干预24，48，72 h后，吡非尼酮0.15，0.3，1 g/L组间细胞增殖抑制率、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分泌量均差异有显著性意义(P<0.05)。结果证实，细胞因子抑制剂吡非尼酮对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白的分泌、转化生长因子β1的表达及细胞增殖活性有明显的抑制作用。

两种方法培养人胎盘间充质干细胞的生物特性比较

背景:胎盘间充质干细胞能够为细胞治疗提供理想的种子细胞,但其培养未曾使用过胰酶冷消化法,故对此方法进行探索,并与组织块法进行比较,从中筛选出一种方便易行、培养成功率更高的方法.目的:观察胰酶冷消化法与组织块法分离培养的人胎盘间充质干细胞的生物学特性.方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘间充质干细胞(n=6).记录胎盘间充质干细胞首次出现时间及原代培养周期,绘制第3代细胞生长曲线,流式细胞仪分析第3代细胞表面标志,检测其向成神经及成脂方向诱导分化能力.结果与结论:①使用上述2种培养方法均可获得胎盘间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P ＜ 0.05),原代培养周期短于组织块法(P＜ 0.05);②生长曲线提示在进入平台期后的各个时间点胰酶冷消化法培养的细胞数量明显多于组织块法(P＜0.05);③2种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45;④2种方法培养的胎盘间充质干细胞经诱导后均具有成神经及成脂分化潜能;⑤上述结果表明,对于胎盘间充质干细胞的培养而言,胰酶冷消化法具有明显优势.

以EdU体外标记人脐带间充质干细胞：5，10μmol/L是其适浓度

背景：EdU为新一代细胞核标记物，目前对此标记的研究较少。
　　目的：采取EdU标记人脐带间充质干细胞，筛选出EdU标记人脐带间充质干细胞的适浓度。
　　方法：采用组织块法分离、纯化及传代培养人脐带间充质干细胞，倒置显微镜观察其形态及生长情况，流式细胞仪鉴定细胞表面标志物，并进行成脂诱导分化能力鉴定。分别采用5，10，20，50，100μmol/L浓度的EdU标记脐带间充质干细胞24 h，选择标记率高的优化浓度，绘制细胞增殖曲线。
　　结果与结论：倒置显微镜下观察细胞为贴壁生长，形态为长梭形，且EdU标记后的细胞形态与其一致，流式细胞仪检测CD44呈阳性表达，成脂诱导后具有向脂肪细胞分化的能力。5，10μmol/L EdU的标记率高，两种浓度标记的人脐带间充质干细胞生长曲线未见明显差异，故5，10μmol/L是体外标记人脐带间充质干细胞的适浓度。

体外不同培养方法对血管平滑肌细胞生物学性状影响的比较研究

目的探讨体外不同培养方法对血管平滑肌细胞生物学性状的影响.方法分别用酶消化及组织块法分离、培养血管平滑肌细胞,对细胞的形态、生长增殖及平滑肌α-肌动蛋白表达情况进行观察与检测.结果组织块法原代培养得到的细胞数高于酶消化法,前者较后者细胞生长速度快,两者细胞均表达平滑肌α-肌动蛋白.结论组织块法是适合血管组织工程获取血管平滑肌种子细胞的培养方法.

不同年龄供体人牙周膜细胞原代培养成功率的比较

目的:通过研究供体年龄对组织块法原代培养人牙周膜细胞的影响,寻找人牙周膜细胞原代培养的佳供体年龄,为便捷、快速地获得大量人牙周膜细胞提供理论依据.方法:将在口腔外科门诊收集正畸拔除的12～28岁青少年健康前磨牙68颗,按供体年龄分为3组:12～14岁组、15～18岁组和19～28岁组,采用组织块法原代培养人牙周膜细胞并传代,通过形态学和免疫化学染色方法对其进行鉴定.结果:不同年龄组牙周膜经组织块法原代培养获得的人牙周膜细胞的成功率不同,12～14岁组高,成功率为66.67%;15～18岁组次之,成功率为8.57%;19～28岁组低,成功率为0.12～14岁和15～18岁组传至第3代细胞免疫组织化学检测显示细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,表明为中胚层组织来源.结论:供体年龄对体外原代培养人牙周膜细胞成功率有很大影响,12～14岁为佳供体年龄.

小型猪牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的:体外分离培养小型猪牙周膜细胞,为建立小型猪体内实验动物模型及进行牙周组织再生的研究奠定实验基础.方法:无菌拔除小型猪上下颌4颗切牙及4颗尖牙,采用组织块法原代培养小型猪牙周膜细胞并传代,绘制生长曲线,通过形态学和免疫组织化学染色方法对其进行鉴定.结果:组织块法成功培养小型猪牙周膜细胞,培养成功率为50%,其中切牙培养的成功率高达100%,尖牙培养成功率为0.细胞生长良好,呈梭形或多角形,免疫组织化学鉴定细胞抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,为中胚层来源的细胞.结论:小型猪的牙周膜细胞可成功培养,切牙的培养成功率较高,有望为牙周组织再生研究提供有用的细胞来源,小型猪牙周膜细胞可作为体内实验动物模型.