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肝细胞、胰岛细胞与储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响
目的:探讨肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响.方法:采用改良胶原酶消化法分离获得大鼠肝细胞和储脂细胞,同时利用梯度离心分离胰岛细胞.分两组实验,肝细胞培养组(对照组),肝细胞用RPMI1640、胰岛素10-7mol/L、100 mL/L FBS及地塞米松10-8 mol/L配成细胞悬液,2 mL放入9 cm2培养瓶中连续培养15 d(37℃50mL/LCO2).肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养组(实验组):将1×107/L的储脂细胞2 mL先加入培养瓶中,培养条件及培养液同肝细胞培养组,培养48 h后弃上清后将肝细胞2×108/L 2 mL和胰岛细胞(100个)分别加入并观察肝细胞存活情况;全自动生化分析仪测定培养上清液中总蛋白及尿素氮的含量;两组细胞均在培养10 d行细胞组织学及组织化学检测,包括肝细胞HE染色、肝细胞内糖原PAS染色及葡萄糖-6-磷酸酶染色检测.结果:培养第7 d对照组部分肝细胞脱落,核固缩,胞质破碎分解.而实验组肝细胞粘壁生长好,肝细胞、储脂细胞和胰岛细胞相间形成团状和索形.培养10 d对照组肝细胞核完全固缩,胞质破碎分解,糖原、葡萄糖-6-磷酸酶的表达消失;实验组肝细胞呈片状,胞质饱满,糖原、葡萄糖-6磷酸酶的表达良好.培养5 d后实验组白蛋白及尿素氮的合成明显高于对照组(P＜0.05).结论:肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养明显延长肝细胞存活期.
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川芎嗪及大蒜素对剪应力诱导的内皮细胞分泌血管性血友病因子与血小板聚集的影响
模拟体内血管壁-血液-血流相互作用,观察川芎嗪和大蒜素对剪应力诱导的血管内皮细胞(EC)分泌血管性血友病因子(von Willibrand factor,vWF)以及血小板聚集的影响,为川芎嗪和大蒜素的临床应用提供实验依据.一、材料与方法1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养:采用胶原酶消化法分离细胞,并将其接种在特制的直径为45mm的光学玻璃片上(预先用0.5%的明胶包被),细胞种植密度(4～9)×105个/玻片.以原代细胞进行剪切实验.
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新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定
背景：组织工程需要大量的种子细胞，成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大，不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法，探索一种操作简便，既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法，为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨，以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞，进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好，具备典型成骨细胞特性，细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多，细胞存活率高(P<0.05)；且比分段胶原酶消化法操作简单，耗时短。组织块法操作为简单，对细胞损伤较小，但是细胞数量低、耗时长，很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。
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两种方法培养骨质疏松症小鼠脂肪干细胞的比较
背景:获得充足的脂肪干细胞是自体移植修复骨质疏松症骨缺损的前提,因此如何高效、简便、经济的获得自体原代脂肪干细胞是治疗骨质疏松症的关键.目的:采用组织块法和胶原酶消化法体外培养骨质疏松症小鼠脂肪干细胞,并对两种培养方法进行比较分析.方法:切除雌性C57BL/6小鼠双侧卵巢,制作骨质疏松模型,造模成功后取小鼠皮下脂肪组织,分别采用组织块法和胶原酶消化法分离培养脂肪干细胞.应用流式细胞仪检测第3代脂肪干细胞表面特异性抗原;培养7d后,检测细胞产量;检测第3代脂肪干细胞的增殖;检测第4代脂肪干细胞的成脂及成骨分化能力.结果与结论:①组织块法培养第3代细胞CD34、CD146、Sca-1表达率分别为(15.22±1.85)％、(75.55±3.36)％、(83.48±4.22)％,胶原酶消化法第3代细胞CD34、CD146、Sca-1表达率分别为(13.46±2.21)％、(76.62±2.47)％、(84.84±3.56)％;②组织块法每毫克脂肪组织获得的细胞产量高于胶原酶消化法(P＜0.05);③培养24 h后,组织块培养法的细胞增殖率高于胶原酶消化法;④两种方法得到的脂肪干细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞方向分化,两组间成脂量及成骨量比较差异无显著性意义(P＞0.05);⑤结果表明,组织块法比胶原酶消化法更适合体外培养脂肪干细胞,可为骨质疏松症患者自体移植脂肪干细胞治疗骨质疏松性骨折和骨缺损研究提供充足的细胞来源.
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大鼠脂肪干细胞两种培养方法的比较
目的 采用组织块培养法和胶原酶消化法体外培养大鼠脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),并对两种培养方法进行比较分析.方法 分离SD大鼠腹股沟处脂肪组织,分别采用组织块培养法和胶原酶消化法获取ADSCs,并对其进行原代培养和传代培养,观察细胞形态,比较细胞的产量和增殖能力;分别用化学成脂诱导剂和化学成骨诱导剂诱导ADSCs分化,观察其分化情况,并计算成脂量.结果 组织块培养法和胶原酶消化法培养ADSCs的成功率分别为79％和53％,获得的第4代ADSCs多为成纤维细胞样,长梭形或纺锤形,无形态学差异,传至第8代,细胞生长状态良好,传代后细胞性状均一,生物学特性稳定;培养第7天,组织块培养法每毫克脂肪组织获得的细胞产量高于胶原酶消化法,差异有统计学意义(P＜0.05);第4代ADSCs生长曲线均为相似的“S”型,细胞倍增时间分别为96.56和95.84 h;ADSCs均可向脂肪细胞和骨细胞方向分化,培养第7天,两组间成脂量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脂肪组织块培养法是更适合的体外获取ADSCs的方法.
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SD大鼠成骨细胞培养方法的改良
目的:建立大鼠成骨细胞的分离、培养方法,并进行改良.方法:分别应用酶消化法、传统的植块法和采用胶原酶消化结合骨片贴附法进行成骨细胞原代培养,通过细胞形态学、Von Kossa钙结节染色和免疫印迹对细胞纯度进行鉴定,通过生长曲线对3种方法取得的原代细胞生长情况进行比较.结果:3种培养方式均可获得高纯度成骨细胞,应用胶原酶消化结合骨片贴附法可以长期获得具有稳定生物学特征的成骨细胞.结论:胶原酶消化结合骨片贴附法可以较长期获得高纯度成骨细胞.
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烟酰胺对白细胞介素-1β所致大鼠胰岛细胞损伤的保护
1型糖尿病被认为是一种遗传易感性自身免疫性疾病，由免疫介导损伤胰岛β细胞所致。本实验采用离体培养的新生大鼠胰岛，进一步研究白细胞介素-1β(IL-1β)对胰岛的细胞毒作用及一氧化氮(NO)的介导作用，且从细胞病理进行证实，并探讨烟酰胺(NAA)对胰岛细胞的保护作用及其机制。 一、方法 1.胰岛细胞的分离及培养(胶原酶消化法)：选用出生7天的SD大鼠，摘取胰腺，4℃ RPMI1640冲洗2遍，剪碎，加入Ⅴ型胶原酶消化，不锈钢筛滤去组织碎片，收集滤液。将所获胰岛悬浮于含15%胎牛血清的RPMI1640中培养48小时后收集细胞，Ficoll 400不连续密度梯度离心纯化。显微镜下计数分装于24孔培养板中，每孔30个细胞。
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胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠RASMCs生长、增殖及分化对比观察
目的 比较胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMCs)生长、增殖及分化的影响.方法 选择6~8周龄雄性SD大鼠6只,取胸主动脉及主动脉弓部,保留中膜备用.分别采用胶原酶消化法、组织块贴壁法培养RASMCs.采用α-肌动蛋白免疫荧光染色法鉴定RASMCs,并比较两种方法培养第0、24、36、48、60、72、84、96 h RASMCs生长情况.采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期.采用实时定量PCR法检测细胞表型标志基因表达,包括收缩型标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转胶蛋白(TAGLN)、肌球蛋白重链11(MYH-11)、转录因子1(SP-1)及合成型标志基因骨桥蛋白(OPN).结果 胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离出RASMCs,细胞纯度均在95%以上.培养36、48、60、72 h时,组织块贴壁法分离、培养的RASMCs计数多于胶原酶消化法(P均<0.05).培养36、48、60、72 h时,胶原酶消化法分离、培养的RASMCs活力优于组织块贴壁法(P均<0.05).两种方法分离、培养的RASMCs G1、G2、S期细胞所占比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05).胶原酶消化法分离、培养的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相对表达量均高于组织块贴壁法,OPN mRNA相对表达量低于组织块贴壁法(P均<0.05).结论 胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离、培养出RASMCs.胶原酶消化法分离、培养的RASMCs生长、增殖较慢,但保持收缩表型;组织块贴壁法分离、培养的RASMCs生长、增殖较快,但有向合成表型转化的趋势.
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胃癌细胞p21蛋白的表达与细胞凋亡的关系
我们应用免疫组织化学方法研究p21蛋白在胃癌细胞中的表达,探讨p21蛋白与胃癌细胞生物学特性及预后的关系,现报道如下.一、材料与方法1.标本处理:36例胃癌组织均取自我院2000年2月～2001年3月外科手术患者.其中男23例,女13例.年龄为34～73岁.取2 cm×2 cm大小新鲜肿瘤组织,平均分为两部分.一部分用胶原酶消化法收集肿瘤细胞.按常规方法抽取DNA并配制成终浓度为0.1μg/L的应用液于-200℃保存,作肿瘤细胞DNA测定.另一部分常规固定,石蜡包埋,5 μm连续切片,常规苏木素-伊红(HE)染色.判定肿瘤细胞存在以后,行免疫组织化学方法检测.
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L-精氨酸对高糖引起内皮功能失调的保护作用
目的通过研究L-精氨酸和NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯对人脐静脉内皮细胞产生一氧化氮和超氧阴离子的影响以探讨L-精氨酸对高糖引起内皮功能失调的保护作用.方法不同浓度L-精氨酸、NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯、葡萄糖和胰岛素加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,24 h后分别测定细胞培养液中一氧化氮合酶和超氧化物歧化酶活性及一氧化氮和超氧阴离子浓度.结果 25 mmol/L葡萄糖使内皮细胞一氧化氮合酶活性增高,一氧化氮产生增加,超氧化物歧化酶活性下降,超氧阴离子产生增加;L-精氨酸对一氧化氮合酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶的影响与对照组相比无显著性差异(P>0.05),但可以使超氧阴离子产生减少;25 mmol/L葡萄糖+L-精氨酸使内皮细胞一氧化氮合酶活性增强,一氧化氮产生增加,L-精氨酸可以改善高糖引起的超氧阴离子升高.不同浓度的胰岛素使内皮细胞一氧化氮合酶活性增高,一氧化氮产生增加,对超氧化物歧化酶活性和超氧阴离子产生无明显影响;不同浓度胰岛素+L-精氨酸使内皮细胞一氧化氮合酶活性增强,一氧化氮产生增加,对超氧化物歧化酶活性无明显影响,但可以使超氧阴离子水平降低.100 μmol/L NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯使内皮细胞一氧化氮合酶活性下降,一氧化氮产生减少,对超氧化物歧化酶活性无明显影响,但使超氧阴离子产生增加;25 mmol/L葡萄糖+NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯使内皮细胞一氧化氮合酶活性下降,一氧化氮产生减少,但对高糖引起的超氧化物歧化酶活性下降和超氧阴离子升高无明显影响.10 mu胰岛素+10 μmol/L NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯和100 mu胰岛素+100 μmol/L NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯使内皮细胞一氧化氮合酶活性下降,一氧化氮产生减少,对超氧化物歧化酶活性无明显影响,但使超氧阴离子升高.结论 L-精氨酸对一氧化氮合酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶无明显影响,但可以使超氧阴离子产生减少;NG-硝基-L-精氨酸-甲基酯使内皮细胞一氧化氮合酶活性下降,一氧化氮产生减少,对超氧化物歧化酶活性无明显影响,但使超氧阴离子产生增加.
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氢对脂多糖刺激的大鼠肺间质巨噬细胞的影响
目的：观察氢饱和盐水对脂多糖（LPS）刺激的大鼠肺间质巨噬细胞（PIMs）分泌促炎细胞因子的影响。方法：应用胶原酶消化法结合肺泡耗竭灌洗和肺循环灌洗技术分离纯化SD大鼠PIMs，在用常规RPMI－1640培养基或含氢RPMI－1640培养基的情况下，用LPS（1 mg／L）刺激细胞一定时间，ELISA法检测细胞培养上清中TNF－α和IL－1β的含量，用RT－PCR技术分析细胞中TNF－α和IL－1βmRNA的表达。结果：各细胞因子的浓度随着LPS刺激时间的延长而升高，培养上清中TNF－α和IL－1β的浓度分别于LPS刺激后3和6 h达到高峰；选取各细胞因子表达高峰的时点观察含氢培养基对其表达的影响，发现含氢培养基可抑制LPS诱导的TNF－α和IL－1β。 LPS刺激PIMs后，TNF－α和IL－1βmRNA的表达也增高，分别于LPS刺激后2和3 h达到高峰，含氢培养基对TNF－α和IL－1βmRNA的表达也具有负向调节作用。结论：在体外培养的大鼠PIMs，含氢培养基可抑制LPS诱导的TNF－α和IL－1βmRNA表达及其蛋白合成释放。
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脂肪源性干细胞无酶分离培养方法的研究
目的：探索适合临床治疗应用的脂肪源性干细胞（ADSCs）分离培养方法。方法分别采用无酶分离法和胶原酶消化法从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养细胞，对比分析分离的间充质干细胞特性。结果无酶分离法所需时间仅为胶原酶消化法的1/3，分离的细胞在细胞形态学、增殖能力、免疫表型、分化潜能等特性与胶原酶消化法分离培养的细胞一致。结论无酶分离法能够从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养出ADSCs ，是一种安全可靠、适合临床应用的ADSCs分离培养方法。
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子宫腺肌病病灶细胞的培养与鉴定
目的：原代培养及鉴定子宫腺肌病病灶细胞，为研究子宫腺肌病发病机制与药效学提供新的理想实验模型。方法采用胶原酶消化法对人子宫腺肌病细胞进行原代培养，并采用免疫细胞化学技术鉴定。结果成功培养了6例子宫腺肌病细胞并均经免疫细胞化学法鉴定证实，成功率为75％；第1代与第8代细胞的生长曲线基本一致。结论胶原酶消化法培养的子宫腺肌病细胞性能稳定，后续研究可选择3～6代细胞作为药物干预模型，细胞传代后4～5天加药物干预，选择24小时作为药效学作用的检测时间点。
