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绿色荧光蛋白放射免疫分析试剂盒的研制
绿色荧光蛋白(GFP)于1962年在一种学名为 Aequorea Victoria的水母中发现,包含238个氨基酸残基[1-2]。其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会吸收蓝光的部分能量,发出绿色荧光。GFP 常用于标记某些特定的 RNA、内源性代谢产物以及靶蛋白[3],可通过荧光显微镜实时观察,也可通过荧光激活细胞,分选分离细胞[4]。这一活体生物标记[5]特性,使得 GFP成为实时观察细胞、组织、器官不可或缺的工具[6],在转基因动物生产中也得到了广泛的应用[7-12]。
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拉米夫定--部分调节HepG2.2.15细胞干扰素诱导基因表达
为了解抗病毒核苷类似物拉米夫定(3TC)处理的Hep.2.15细胞干扰素(IFN)抗病毒基因表达谱以及3TC对IFN信号转导途径的影响而开展此项研究.具体方法:将培养的Hep2.2.15细胞用3TC处理,再以IFN-α刺激6 h,分离细胞总RNA,经逆转录、32P标记后与尼龙膜上的探针基因芯片进行分子杂交--Macroarray法,并以此来分析3TC处理的Hep2.2.15细胞IFN抗病毒基因表达谱.用ELISA、Dot b1ot、Southern blot分析3TC处理的Hep2.2.15细胞分泌HBV抗原、细胞外HBV DNA以及细胞内复制中间体HBVDNA.Northerm blot证实单个IFN抗病毒基因如MxA、2'5'-寡腺苷酸合成酶(2'5'-OAS)以及IFN信号转导途径分子STAT1等表达情况.
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肠上皮内淋巴细胞分离鉴定
肠上皮内淋巴细胞(intestine intraepithelial lymphocytes,iIEL),是机体内数量多的淋巴细胞群体之一.在黏膜免疫防御和口服免疫耐受形成等方面发挥重要的作用.本文参考国内外多种方法,选用机械和消化法分离细胞、密度梯度离心法纯化iIEL,摸索快速、高效、稳定的iIEL提取方法,并对其增殖和表型进行了初步分析.
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川芎嗪及大蒜素对剪应力诱导的内皮细胞分泌血管性血友病因子与血小板聚集的影响
模拟体内血管壁-血液-血流相互作用,观察川芎嗪和大蒜素对剪应力诱导的血管内皮细胞(EC)分泌血管性血友病因子(von Willibrand factor,vWF)以及血小板聚集的影响,为川芎嗪和大蒜素的临床应用提供实验依据.一、材料与方法1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养:采用胶原酶消化法分离细胞,并将其接种在特制的直径为45mm的光学玻璃片上(预先用0.5%的明胶包被),细胞种植密度(4~9)×105个/玻片.以原代细胞进行剪切实验.
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骨组织工程研究进展
组织工程学是一门应用工程学和生命科学的原理和方法,以载体结合被分离细胞,并能在宿主体内降解释放细胞,形成新的有功能组织的科学.近年来应用骨组织工程临床治疗骨缺损成为目前研究的热点,可以减少自身骨移植的供区损伤,也可避免同种异体移植供体来源有限和不可避免的免疫排斥反应.目前骨组织工程的研究主要包括:细胞种植基质材料的研究开发,种子细胞的体外培养,组织培养中各种因子的调控作用.
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简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备
目的 采用碳二亚胺.N-基琥珀酰亚胺(EDC.NHS)方法在羧基磁珠表面偶联抗体.制备可高效分离细胞的免疫磁珠.方法 用EDC和NHS活化磁珠表面羧基,活化的羧基再与抗体上氨基进行反应,从而将抗体偶联于磁珠表面,获得免疫磁珠.使用高性能纳米粒度分析仪(HPPS)、二辛可酸(BCA)蛋白定量试剂盒、流式细胞仪、透射电镜(TEM)表征磁珠的粒径、磁珠表面联接的抗体量及其免疫活性.结果 HPPS检测磁珠平均水力学粒径为110nm;磁珠表面偶联52.4μg抗CD11a+抗体.mg磁珠.经磁分离后细胞的流式分析结果表明,CD11a+免疫磁珠可以有效分离髓系白血病细胞系(KG-1a)细胞,免疫磁珠均匀结合于细胞表面,且不影响细胞的活性.结论 成功制备可用于细咆分离且不影响分离后细胞活性的新型免疫磁珠.
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小檗碱对急性分离成年大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响
目的 研究小檗碱对急性分离大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响.方法 采用酶解法分离单个大鼠心肌细胞,用钙敏感的荧光指示剂Fluo-3/AM染色,以荧光强度(FI)来代表[Ca2+]i,应用激光扫描共聚焦显微镜实时监测FI的变化.结果在静息状态下,小檗碱(3~100μmol/L)对[Ca2+]i无影响.3~100μmol/L小檗碱对KCl 60mmol/L介导的钙内流也无影响.但小檗碱(30和100μmol/L)对caffeine 10mmol/L引起的钙动员有明显促进作用(P<0.01).结论小檗碱对于KCl通过电压依赖性钙通道(VDC)介导的[Ca2+]i升高无影响;但小檗碱(30和100μmol/L)可能通过影响RyRs而促进肌浆网(SR)内钙外流,也可能对SR钙摄取,钙的跨膜转运及Na+-Ca2+交换有抑制作用.
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动物组织细胞分离纯化方法学
要了解某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征,就必须将其在体外培养增殖获得足够的数量以供研究,这首先就必须获取种子细胞.从血液、淋巴液等液体中分离细胞时,可直接进行纯化,从心脏、肝脏等器官分离细胞时,一般的方法是先获得细胞悬液,再对其进行分离纯化.近年来细胞分离纯化技术发展较迅速,它们主要依据两类原则:(1)各种细胞不同的物理性状,如:大小、密度、表面电荷及黏附能力等;(2)各种细胞表面受体或抗原的差异.本研究对其中一些方法在比较的基础上进行综述.
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锌离子对急性分离的大鼠骶髓后连合核神经元GABAA受体介导电流的抑制作用
采用制霉菌素穿孔膜片箝技术,研究了锌离子(Zn2+)对急性分离的大鼠骶髓后连合核神经元GABAA受体介导电流的作用.结果表明:(1)在箝制电压为-40mV时,GABA可通过GABAA受体介导产生内向电流;(2)此电流可被Zn2+呈非电压依赖性可逆地阻断;(3)在Zn2+存在的情况下,GABA的浓度-效应曲线平行右移.上述结果提示,Zn2+可能通过变构调控机制对GABAA介导的反应产生抑制作用.
关键词: Zn2+ GABA 受体 制霉菌素穿孔全细胞记录 分离细胞 骶髓后连合核 -
一种急性分离视网膜细胞的实验方法
目的:探讨为视网膜细胞实验提供足量且活性高的视网膜细胞的分离方法.方法:取3周的C57小鼠视网膜,用木瓜蛋白酶消化后并吹打,得到细胞悬液后用富氧的溶液灌流,待分离细胞静置沉淀后,用相差显微镜观察视网膜细胞的形态和数量.分析不同类型的视网膜细胞所需的佳酶解时间和佳酶浓度.结果:本实验在不同的酶解时间或酶浓度下使用木瓜蛋白酶对视网膜进行分离消化,得到的细胞数量不尽相同,通过统计得到针对每一种视网膜细胞的优化分离条件.结论:本实验系统地研究并建立了针对分离不同视网膜细胞的有效方法.
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一种简易的滤气装置
随着细胞和组织培养技术的日益成熟,对其操作的要求也越来越严格。在一些原代培养中,如心肌细胞或血管平滑肌细胞或神经细胞等,要求从大体标本取材到分离细胞的全过程有氧气供应,也就是在缓冲液或培养基中通入氧气,以模拟体内生理环境(特殊的组织细胞或实验模型也可要求NO、CO、CO2等气体供给以制造特定的生物组织、细胞生活环境)。
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抗体包被免疫磁珠的研制及其应用
1979年,John Ugelstad等[1]成功地制备了一种均匀性和粒度适宜的聚苯乙烯微球.将其磁化并与抗体连接后,即成为一种分离细胞效果极佳的免疫磁珠-Dynabeads.从此,免疫磁珠得到广泛应用[2,3],并引发了生物分离技术上的一次革命.免疫磁珠的主要特点有:(1)分离速度快、效率高、可重复性好;(2)操作简单、不需要昂贵的仪器设备;(3)不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能.迄今,我国尚没有生产高质量免疫磁珠的能力,而进口磁珠的价格昂贵,因而限制了免疫磁珠在我国生物医学研究领域中的应用.我们在综合了国内外新相关技术的基础上,建立了一种合成免疫磁珠的新方法,所获产品的表面特性及分离效果均较良好.