甲肝减毒活疫苗口服免疫动物后的抗体反应

用PLAG微粒包裹甲肝减毒活疫苗制成微球口服免疫恒河猴及昆明种小鼠,用EIA法对HAV-IgM、HAV-IgG、HAV-IgA等抗体进行检测,以筛选一种方便易行的免疫途径.结果表明:恒河猴抗体应答于第3周出现,高峰期在5～6周,达1261mIU/mL,随后逐渐下降,口服加强免疫后,抗体回升,野毒株攻击后,抗体再度回升达1244mIU/mL.初次免疫HAV-IgM滴度为1:4000,加强免疫后滴度为1:1000,野毒株攻击后下降为1:100.对照组仅在野毒株攻击后测到HAV-IgM.小鼠免疫2周后有HAV-IgG抗体产生,4周达高峰,S-IgA抗体1周开始测到,4周达高峰并持续两周后开始下降.微粒包裹疫苗免疫灵长类动物后所诱导产生的抗体应答,对野毒株攻击的保护效果明显.小鼠免疫结果与报道相似,但抗体反应出现的时间较免疫恒河猴的时间有所提前.

甲型肝炎灭活疫苗(L-8株)口服及腹腔注射Bal b/c小鼠的免疫反应评价

目的比较评价甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(L-8株)不同途径接种Bal b/c小鼠所诱导产生的免疫效应.方法将320EU/0.5ml的实验疫苗1次口服及腹腔注射免疫实验动物,于2周、4周时收集血液样本,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测抗体反应,同时动态检测免疫小鼠外周血T淋巴细胞亚群及肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ.结果不论是腹腔注射或是口服免疫均能诱导产生良好有效的体液免疫效应.腹腔免疫后CD+4T细胞百分比轻微下降,而CD+8T细胞百分比上升趋势及幅度明显,CD+4/CD+8比值明显下降;而口服免疫小鼠外周血CD+4T细胞百分比持续上升,CD+8T细胞百分比亦同步升高,两者上升幅度基本一致,CD+4/CD+8比值无明显改变.另外,两种途径免疫接种均可诱导产生高滴度的内源性IFN-γ.结论有必要对甲肝灭活疫苗口服免疫的机制及其开发利用作进一步的研究.

弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-2及NO含量的测定

目的 观察弓形虫P30乳酸球菌(L. lactis/ P30)口服免疫鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-2及NO的变化情况.方法 L. lactis/P30口服免疫BALB/c小鼠,以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照,在第3周、第9周及第12周分别收集各实验组小鼠血清,ELISA法测定血清IFN-γ、IL-2含量;酶法测定NO浓度.结果 L.lactis/ P30口服免疫鼠血清中IFN-γ、IL-2含量均显著高于两对照组,血清中NO含量随着免疫时间延长与两对照组差异逐渐明显.结论 L. lactis/P30口服免疫能有效刺激小鼠细胞因子IFN-γ和IL-2的产生及NO分子的释放.

双歧杆菌肠道内调控表达肠道病毒71型VP1蛋白的实验研究

目的 构建重组肠道病毒71 VP1基因双歧杆菌,制成口服疫苗,用于EV71感染预防. 方法 扩增EV71病毒VP1基因并将其插入到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBBAD/Xs中,构建VP1表达载体(pBBADs-VP1),通过Western blot检测VP1蛋白在pBBADs-VP1转化菌中的表达.选取BALB/c小鼠,分为B-VP1组、VP1组、GFP组和生理盐水组,B-VP1组口服pBBADs-VP1-转化双岐杆菌,VP1组腹腔注射大肠埃希菌表达纯化的重组VP1蛋白,GFP组口服pBBADs GFP转化双岐杆菌,生理盐水组口服生理盐水,观察pBBADs-VP1-转化双岐杆菌口服免疫对EV71感染的免疫反应:包括病毒的中和抗体滴度、抗EV71-VP1抗体以及诱导脾脏和淋巴集结中Th1免疫反应. 结果 与GFP组及生理盐水组比较,B-VP1组及VP1组中和抗体滴度及抗EV71 VP1抗体水平,均显著增加;口服表达VP1蛋白长双歧杆菌和注射VP1蛋白都会诱导Th1细胞因子免疫反应(P＜0.05),表达VP1蛋白长双歧杆菌较易诱导局部肠道的Th1模式,而注射VP1蛋白较易诱导全身性免疫.攻毒试验显示,VPI和B-VP1组新生鼠攻击后第15 d(剂量1 000 LD50)存活率分别为20.00％和16.67％,对照组无小鼠存活. 结论 利用长双歧杆菌表达VP1蛋白的口服疫苗可能成功激发针对EV71病毒感染的特异性免疫应答.用表达VP1的重组双歧杆菌免疫母鼠,可以赋予新生小鼠以保护.

肠上皮内淋巴细胞分离鉴定

肠上皮内淋巴细胞(intestine intraepithelial lymphocytes,iIEL),是机体内数量多的淋巴细胞群体之一.在黏膜免疫防御和口服免疫耐受形成等方面发挥重要的作用.本文参考国内外多种方法,选用机械和消化法分离细胞、密度梯度离心法纯化iIEL,摸索快速、高效、稳定的iIEL提取方法,并对其增殖和表型进行了初步分析.

佐剂在龋病粘膜免疫中的应用及展望

免疫防龋是预防龋病的重要途径,疫苗免疫机体的理想方法是口服免疫,口服免疫不但在受抗原刺激的粘膜部位产生免疫应答,还能在远处甚至全身诱导免疫应答.然而,大多数可溶性蛋白抗原口服免疫,其免疫原性低,而且常诱生免疫耐受,因此,为了提高防龋疫苗的免疫原性,有必要综述佐剂在龋病粘膜免疫中的现状及展望.

可生物降解微球甲型肝炎减毒活疫苗口服免疫恒河猴的免疫应答

目的探索用一种新型的甲型肝炎减毒活疫苗及其免疫途径.方法用可生物降解的材料聚乳酸/乙醇酸(PLA/PLG)包裹甲型肝炎减毒活疫苗,制成微球型疫苗,检测微球的大小及在体外病毒释放的状况,和口服免疫恒河猴后病毒在体内繁殖及免疫应答状况.结果微球大小在6～10μm范围,体外病毒抗原释放长达27d左右,体外抗原释放高峰在3～7d,口服免疫恒河猴后,约1w左右开始排毒,以后一直呈间断排毒.抗体应答于第3w出现,高峰期在5～6w,达1261mIU/ml,随后逐渐下降,口服加强免疫后,抗体回升,野毒株攻击后,抗体再度回升达1244mIU/ml.结论微球型甲型肝炎减毒活疫苗口服免疫恒河猴后,能引起一定水平的免疫应答.

壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌外膜蛋白K微球疫苗的制备及其口服免疫效果

目的 制备壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌外膜蛋白(outer membrane protein,omp)K微球疫苗,并检测其对大黄鱼的口服免疫效果.方法 采用乳化-离子交联法制备副溶血弧菌ompK微球疫苗,筛选表面活性剂司盘-80添加量及壳聚糖包被浓度,经正交试验优化微球疫苗的制备工艺,筛选微球疫苗的冻干保护剂.检测采用优化条件制备的微球疫苗的理化特性及其在不同条件下的释放特性,并将微球添加到饵料中,连续5d投喂大黄鱼,第28天以副溶血弧菌zj2003攻击,检测口服微球疫苗的免疫保护率.结果 适司盘-80添加量为2％～4％,壳聚糖包被浓度为0.6％～0.7％;优化的微球疫苗制备条件为:抗原蛋白浓度10 mg/ml,海藻酸钠浓度1.0％,水油比1∶2,搅拌速度2 000 r/min;微球疫苗的佳冻干保护剂为2％甘露醇;以优化的条件制备的微球圆整性、分散性好,平均直径为(1.91±1.02)μm,表现出酸性条件稳定、中性和弱碱性条件溶胀的特性;微球疫苗口服免疫的大黄鱼对副溶血弧菌zj2003攻击表现出中等程度的保护力.结论 制备了壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌ompK微球疫苗,并验证了其口服免疫的有效性,为鱼类口服弧菌疫苗的研制及应用奠定了基础.

壳聚糖-海藻酸盐复合微囊疫苗的制备及其对斜带石斑鱼的口服免疫效果

目的 制备包裹哈维弧菌(Vibrio harve yi,Vh)重组外膜蛋白OmpK的壳聚糖-海藻酸钠复合微囊疫苗,并检测其对斜带石斑鱼的口服免疫效果.方法 采用乳化-复乳化法将壳聚糖、海藻酸钠包裹哈维弧菌重组外膜蛋白OmpK,制备微囊疫苗,测定其粒径、包裹率及载抗原量;经口灌服免疫斜带石斑鱼,2周后进行加强免疫,设OmpK蛋白组和空白对照组,ELISA法检测免疫后斜带石斑鱼血清及后肠黏膜上清抗体水平;于免疫后30 d,经斜带石斑鱼腹腔注射1.0× 107CFU/ml的哈维弧菌,计算各组相对保护率(relative percent survival,RPS).结果 微囊为球形或类球形,粒径5.0～ 20.0 μm,平均粒径10.6 μm;微囊中蛋白平均包裹率为71.26％,平均载抗原量为1.67％.微囊疫苗组血清抗体效价峰值为29,明显高于OmpK蛋白组(P＜0.01);微囊疫苗组后肠黏膜上清的吸光值(A450-A 630)明显高于OmpK蛋白组和空白对照组(P＜0.01).微囊疫苗组的RPS达62.5％,高于OmpK蛋白组(P＜0.01).结论 制备的壳聚糖-海藻酸盐复合微囊疫苗口服石斑鱼后,具有较好的免疫效果,作为鱼类口服疫苗的投递载体是可行的.

PELA-OmpK微球疫苗的部分特征及其对鲫鱼的口服免疫效果

目的 研究聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide-co-polyethylene glycol,PELA)包裹哈维弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK制备的微球疫苗的部分特性及其对鲫鱼(Carassius auratus gibelio)的口服免疫效果.方法 用可生物降解的合成高分子材料PELA,通过乳化溶剂挥发法包裹OmpK,制备微球疫苗,Bradford法测定蛋白浓度,计算蛋白包裹率；通过扫描电镜观察微球粒径大小及其在4℃保存不同时间的形貌.取鲫鱼随机分为3组:微球疫苗组、OmpK蛋白组和空白对照组,前两组采用疫苗或蛋白拌饲投喂方式口服免疫,投喂3d,间隔7d,再投喂3d加强免疫；对照组投喂不含疫苗的饲料.加强免疫4周和8周后,经腹腔注射20LD50的Vh EcGS020802株攻击,记录各组鱼死亡数,计算相对免疫保护率.结果 制备的PELA-OmpK微球疫苗中OmpK蛋白的包裹率达78％.微球粒径小于12μm,且90％微球的粒径小于5μm.4℃保存10d微球表面光滑、圆整；保存30 d PELA微球降解,粒径较大的微球表面出现空洞；保存60 d可见大量碎片,微球表面毛糙松散,出现多个空洞.微球疫苗加强免疫鲫鱼4周和8周后,对活菌攻击的相对免疫保护率分别为70％和48％,而口服OmpK蛋白组和空白对照组鱼全部死亡.结论 用PELA包裹裸疫苗制备成微球疫苗,对抗原具有一定的保护作用,PELA用作鱼类口服疫苗的投递载体是可行的.

食蟹猴口服免疫重组HEV病毒样颗粒的效果

用于口服免疫的植物源性HBsAg的结构特征

经皮与口服免疫诱生的粘膜和全身体液免疫应答的比较

产肠毒素大肠杆菌混合载体疫苗的免疫原性评价

本研究在构建表达ETEC菌毛抗原CFA/I、CS6和CS3、融合肠毒素LTB/STm的混合活载体疫苗的基础上,以两株福氏志贺载体疫苗,同等剂量相混合进行免疫.通过口服免疫,该混合多价活疫苗能够诱导机体产生相应的抗ETEC特异的血清和黏膜抗原抗体反应,达到了与各单独疫苗株一致的免疫效果,同时保持了载体志贺菌自身的免疫原性.

弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠适当免疫剂量的探讨

目的:探讨弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠的适当免疫剂量,为体内免疫活性的研究提供直接的实验数据.方法:用弓形虫P30乳酸球菌口服免疫BALB/c实验小鼠,设三个免疫剂量组,分别为3×109CFU、3×108CFU、3×107CFU,同时设生理内水对照组.免疫结束2 w后,各实验组分别收集小鼠血清,以ELISA法测定血清中特异性抗体IgG的含量;各实验组取5只小鼠,以100个弓形虫强毒力RH株速殖子做虫体攻击实验,记录死亡时间.结果:三个免疫剂量组,在小鼠体内产生的抗体IgG有一定的差异(P＜0.01),但免疫剂量组一(3×109 CFU)与免疫剂量组2(3×108 CFU)几乎没有差别,免疫剂量组二偏差稍大;免疫剂量组一小鼠的平均存活时间有所延长,免疫剂量组二的小鼠先出现死亡现象.结论:确定了3×109 CFU的免疫剂量,在此剂量下,小鼠的保护性效果则比其他剂量组有所提高.

冀、京、吉犬群犬腺病毒中和抗体调查

目的 为表达狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒(CAV-2)重组狂犬病口服疫苗的投放工作提供流行病学依据.方法 通过病毒中和试验对随机采自河北省,北京市,吉林省等地的387份犬血清进行犬腺病毒中和抗体检测,以确定犬群腺病毒感染率.结果 河北、吉林农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,阳性率为16%(30/192),而北京市犬腺病毒中和抗体阳性率高达69%(135/195),说明城乡犬只犬腺病毒中和抗体存在明显差异.结论 农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,适用于CAV-2及其重组疫苗首次免疫、尤其是口服免疫.

屎肠球菌Hyl蛋白的免疫保护性研究

目的 用基因工程方法获得屎肠球菌类透明质酸酶(Hyalronidase,Hyl)蛋白,经口服免疫小鼠后,探讨机体产生的免疫应答和抗感染保护作用.方法 Hyl用Ni2+-NTA 柱纯化后,作为抗原给小鼠灌胃进行免疫,ELISA检测小鼠血清IgG、IgA、小肠粘液sIgA和粪便sIgA.并用屎肠球菌TX0016腹腔攻击已免疫的小鼠,观察其免疫保护性.结果重组蛋白经Ni2+-NTA 柱纯化后,灌胃免疫小鼠后.ELISA检测结果血清IgA、IgG,粪sIgA,肠粘液sIgA明显高于对照组(P<0.01).通过细菌攻击后,小鼠的平均存活时间也明显长于对照组.结论重组蛋白Hyl经口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答,产生高水平的sIgA,发挥局部粘膜免疫作用和抗菌保护作用.Hyl有望作为预防屎肠球菌口服疫苗的候选抗原.

微粒包裹型幽门螺杆菌疫苗口服诱导小鼠粘膜免疫应答的研究

幽门螺杆菌(Helocobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌,为分析Hp超声上清经微粒包裹后对小鼠的口服免疫效果，采用ELISA 法检测血清、唾液、肠粘液的抗体改变情况，ELISPOT法分析派伊尔氏结（PP结）抗原特异性抗体形成细胞（ASC）的数量增减。发现微粒包裹型Hp疫苗免疫后可诱导较高的唾液sIgA水平和肠道sIgA反应，PP结抗原特异性抗体形成细胞（ASC）数量与肠道sIgA水平密切相关。

口服免疫机制及口服疫苗的研究进展

口服免疫可诱导机体产生有效的免疫应答和免疫耐受.其通过胃肠粘膜进行抗原递呈,较经传统注射途径的免疫效果和依从性好,且简易便捷,是更为理想的免疫途径.口服疫苗有多种载体系统,某些经改造的细菌如沙门氏菌、大肠杆菌、特别是乳酸菌属被认为是有前景的口服疫苗载体,因口服后可在肠道寄生繁殖,故可大大提高免疫的效率.本文围绕口服免疫主要的机制和口服疫苗的研究进展进行综述.

幽门螺杆菌超声处理菌液口服免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的从细胞和分子水平探讨小鼠口服免疫幽门螺杆菌超声处理菌液后的粘膜免疫应答.方法 Hp菌超声上清和粘膜佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)口服免疫小鼠,ELISPOT 分析胃粘膜、派伊尔结(Payer's patch PP)抗原特异性抗体分泌细胞(ASC)、RT-PCR分析肠粘膜免疫主要诱导部位PP T细胞因子mRNA表达水平.结果①结合佐剂口服免疫可诱导胃粘膜、PP大量抗原特异性抗体分泌细胞(ASC),尤以sIgA-ASC型居多.②单纯抗原免疫小鼠PP T细胞,早期高表达IL-4,晚期高表达IFN-γ.③抗原+LT免疫小鼠PP T细胞,早期高表达IFN-γ,晚期高表达IL-4.结论单纯抗原口服免疫诱导的抗体分泌细胞数量尤其是sIgA型明显低于联合应用佐剂组,PP体外抗原刺激后先表现为Th2型优势应答,后转为Th1型优势应答,而结合LT免疫,PP则先表现为Th1型优势应答,后转为Th2型优势应答.