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人胚胎生殖干细胞的体外培养研究
本实验在综合分析目前国内外人胚胎生殖细胞(EG细胞)的培养条件后,采用组织块培养法,以同源胚胎的成纤维细胞为饲养层,在不添加任何细胞因子的情况下,对人EG细胞进行体外培养.该培养体系确保了在培养过程中人EG细胞有充足的来源,避免了胰酶以及一些机械操作对原始生殖细胞(PGCs)的损伤,同时也避免了由于用小鼠成纤维细胞做饲养层,而对培养体系造成的异种蛋白的污染.这是关于建立人EG细胞合适的体外培养体系的一次有意义的探索.
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肝硬化组织来源纤维母细胞的分离、培养及鉴定
目的 建立肝硬化组织来源纤维母细胞的分离、培养方法,探讨体外培养纤维母细胞的生物学特性.方法 采用组织块贴壁法等细胞培养技术分离培养肝硬化组织来源纤维母细胞,通过显微摄像、细胞计数研究其形态学变化及生长特性,用细胞免疫荧光及Western blotting等方法检测细胞成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)、波形蛋白的表达情况,对所得细胞进行分析鉴定.结果 2h内组织块贴壁良好,1周左右可见组织块周边有单个的胞体较大的肝细胞样细胞游出,2周左右可见梭形或三角形纤维母细胞游出.传代后细胞呈均一的成纤维细胞样,生长潜伏期短,纤维母细胞生长性状稳定,3、4、5代细胞生长曲线基本一致.细胞免疫荧光结果表明,细胞表达FSP1、波形蛋白呈阳性,阳性率分别为(90.6±1.0)％和(91.2±4.1)％.结论 采用组织块贴壁培养法能获得纯度较高的纤维母细胞,此方法简便、高效、稳定,培养的细胞具有良好的细胞生物学特性.
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人角膜缘干细胞提取方法的比较性研究
目的：比较组织块培养法、酶消化法及平板离心法获取角膜缘干细胞的不同。方法：取得人组织，分别应用组织块培养法、酶消化法及平板离心法获得角膜缘细胞并进行原代细胞培养，对获得的细胞通过免疫组化方法研究其p63、ABCG2及K3表达情况，以比较上述3种方法的不同之处。结果：3种方法均可获取大量阳性表达p63、ABCG2及阴性表达K3的细胞，符合角膜缘干细胞特点，但其中组织块培养法中阴性表达p63的细胞略多，并偶见阳性表达K3的细胞；另外，在提取细胞的实验操作方面，组织块培养法耗时约7天，酶消化法耗时约1天，平板离心法耗时约2天；在获得细胞量方面，1枚人角膜缘材料酶消化法可获得的细胞数量在此3种方法中通常少。结论：平板离心法在目前常用的人角膜缘干细胞提取方法中可能是具优越性的。
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Ⅰ型神经纤维瘤病肿瘤组织中成纤维细胞的纯化培养和鉴定
目的:探讨Ⅰ型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis,NF-1)肿瘤组织中成纤维细胞(fibroblast,FB)体外分离、培养及鉴定的方法.方法:以4例NF-1患者的神经纤维瘤组织为材料,采用组织块法分离培养FB,细胞铺满培养瓶底后传代,差速贴壁法(15min/次)纯化P1、P2代FB.倒置显微镜观察细胞形态学变化.并用免疫细胞化学方法检测成纤维细胞特异蛋白-1、波形蛋白和S-100蛋白表达情况,对培养细胞进行鉴定.结果:组织块法原代培养约5d可见大量细胞从组织块周围迁出,20d左右达80%～90%融合.经纯化后P3代FB成纤维细胞特异蛋白-1和波形蛋白免疫组化染色阳性,阳性率分别为99.4%和99.6%;S-100染色阴性.结论:组织块培养法结合差速贴壁法可成功分离出高纯度NF-1肿瘤组织内FB,该培养方法是一种较理想的NF-1肿瘤组织FB培养方法.
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组织块法培养原代人PDLCs技术的新探讨
目的 探讨组织块法培养原代人PDLCs生长情况和成功率,以及提高组织块法培养原代人PDLCs成功率的方法.方法 采用组织块法培养原代人PDLCs.免疫组化ABC法进行波形丝蛋白(VIM)和细胞角蛋白(CK)的免疫组化染色,进行细胞来源鉴定.倒置显微镜下进行形态学观察,取第4代人PDLCs用MTT法绘制生长曲线.计算细胞培养成功率.结果 组织块法培养原代人PDLCs成功率52.4%.波形丝蛋白染色阳性,细胞角蛋白染色阴性.细胞大多呈长梭形.胞体丰满,伸展良好,核仁清晰,细胞排列均匀,呈漩涡状,火焰状.生长曲线示细胞第3天开始进入对数生长期.结论 本实验组织块法培养原代人PDLCs的成功率为52.4%.为人PDLCs作为种子细胞的牙周组织工程的研究,提供了实验基础和理论依据.
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关键词：
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人牙周膜成纤维细胞原代培养的研究
目的研究如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率.方法以牙槽窝刮取组织块法替代传统的牙根刮取法;以组织块自然贴壁法替代传统的干燥贴壁法.结果48h后细胞游出率为40%,而成功传代率为20%.结论通过对取材和培养方法的改良,可以显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率.
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两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较
背景:人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点.目的:寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法.方法:取5~10 周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7 和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定.结果与结论:两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形.抗-细胞角蛋白7 阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达.胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P < 0.05).提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法.
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人脐带间充质干细胞分离鉴定及移植后对肺癌小鼠化疗的影响
背景：间充质干细胞具备多向分化潜，能促进细胞植入和免疫调节，研究人脐带间充质干细胞分离鉴定方法及移植后对肺癌小鼠化疗的影响能为肺癌治疗提供新的思路。
目的：观察人脐带间充质干细胞分离、鉴定方法及移植后对肺癌小鼠化疗的影响。
方法：取新鲜的新生儿脐带，利用组织块培养法和酶消化法分离、鉴定人脐带间充质干细胞。将Balb/C裸小鼠肺癌模型20只，随机分为化疗组和人脐带间充质干细胞移植组，两组均给予化疗治疗，人脐带间充质干细胞移植组化疗期间联合移植人脐带间充质干细胞治疗。
结果与结论：①瘤质量、肠黏膜组织形态及血常规指标：与单纯化疗的肺癌模型小鼠相比，人脐带间充质干细胞移植组胃肠道红润、有光泽，肠黏膜光滑、完整，瘤质量和血常规指标稳定(P<0.05)；②结果证实：通过组织块培养法和酶消化法能获得成熟的人脐带间充质干细胞，与化疗联合应用可明显减少胃肠道的损害，稳定外周血象。 -
在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化
背景：人脐带间充质干细胞属于一类特殊的干细胞，该类细胞数量有限，且分离、纯化难度系数较大，并且临床上对于该类细胞生物学特性缺乏认识。
目的：研究人脐带间充质干细胞的生物活性特性，探讨人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用。方法：无菌采集剖宫产新生儿脐带，在胶原酶Ⅱ下进行消化，采用组织块培养法分离人间充质干细胞。利用免疫细胞化学染色检测细胞表面标志，观察细胞形态学特性，并采用MTT法检测细胞增殖绘制其生长曲线，将获得的人脐带间充质干细胞进行培养，待细胞生长到70%-80%融合时，采用10μmol/L 5-杂氮胞苷进行24 h诱导。
结果与结论：①组织块贴壁法培养1周后：可见人脐带间充质干细胞，去组织块加入培养液培养后，人脐带间充质干细胞集落生长；②第3代及第10代人脐带间充质干细胞接种24 h内：细胞为潜伏期，此后呈对数生长，倍增时间为30 h；③免疫细胞化学染色结果显示：第3代细胞90%以上表达基质细胞相关表面标志物CD44、CD29等，不表达造血及内皮细胞标志物CD28、CD31；④人脐带间充质干细胞诱导3周后：细胞突起消失，出现不规则形状，诱导4周后呈现圆形，且表达心肌特异性免疫标志物。⑤结果提示人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力：分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-杂氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞。 -
苯肾上腺素对氧化应激损伤成骨细胞形态和Nampt的影响
背景:已有研究显示苯肾上腺素对放射性损伤的唾液腺细胞和上皮细胞等均具有保护作用,但其对过氧化氢造成氧化应激损伤的成骨细胞作用尚不清楚.目的:研究苯肾上腺素对过氧化氢造成的成骨细胞氧化应激损伤中烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)的调控作用.方法:原代培养成骨细胞,随机分为空白对照组、单纯H2O2处理组、苯肾上腺素组和苯肾上腺素+H2O2组(1×10-5mol/L的苯肾上腺素预处理半小时后,300 μmol/L过氧化氢作用于成骨细胞).不同时间点观察细胞,并于24 h时间点收集细胞,提取细胞总RNA和总蛋白,应用半定量RT-PCR和免疫印迹法(Western blotting)检测成骨细胞mRNA调控和蛋白的表达情况.结果与结论:①镜下观察可见单纯 H2O2处理组较空白对照组细胞数量减少、形态皱缩明显;苯肾上腺素+H2O2组在处理12,24和48 h后细胞数量较单纯H2O2处理组均明显增多;②RT-PCR结果显示24 h时间点,单纯H2O2处理组较空白对照组Nampt mRNA表达减少31.23%(P < 0.05);苯肾上腺素+H2O2组较单纯H2O2处理组Nampt mRNA表达增加206.20%(P < 0.05);③Western blotting结果显示24 h时间点,单纯H2O2处理组较空白对照组Nampt 蛋白表达减少67.98%(P < 0.05);苯肾上腺素+H2O2组较单纯H2O2处理组Nampt 蛋白表达增加152.25%(P < 0.05);④提示苯肾上腺素可缓解过氧化氢导致的成骨细胞减少和皱缩,使细胞 Nampt mRNA 和蛋白表达水平上调,Nampt 基因可能是苯肾上腺素对成骨细胞氧化应激损伤作用的相关调控基因.
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两种方法培养骨质疏松症小鼠脂肪干细胞的比较
背景:获得充足的脂肪干细胞是自体移植修复骨质疏松症骨缺损的前提,因此如何高效、简便、经济的获得自体原代脂肪干细胞是治疗骨质疏松症的关键.目的:采用组织块法和胶原酶消化法体外培养骨质疏松症小鼠脂肪干细胞,并对两种培养方法进行比较分析.方法:切除雌性C57BL/6小鼠双侧卵巢,制作骨质疏松模型,造模成功后取小鼠皮下脂肪组织,分别采用组织块法和胶原酶消化法分离培养脂肪干细胞.应用流式细胞仪检测第3代脂肪干细胞表面特异性抗原;培养7d后,检测细胞产量;检测第3代脂肪干细胞的增殖;检测第4代脂肪干细胞的成脂及成骨分化能力.结果与结论:①组织块法培养第3代细胞CD34、CD146、Sca-1表达率分别为(15.22±1.85)％、(75.55±3.36)％、(83.48±4.22)％,胶原酶消化法第3代细胞CD34、CD146、Sca-1表达率分别为(13.46±2.21)％、(76.62±2.47)％、(84.84±3.56)％;②组织块法每毫克脂肪组织获得的细胞产量高于胶原酶消化法(P＜0.05);③培养24 h后,组织块培养法的细胞增殖率高于胶原酶消化法;④两种方法得到的脂肪干细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞方向分化,两组间成脂量及成骨量比较差异无显著性意义(P＞0.05);⑤结果表明,组织块法比胶原酶消化法更适合体外培养脂肪干细胞,可为骨质疏松症患者自体移植脂肪干细胞治疗骨质疏松性骨折和骨缺损研究提供充足的细胞来源.
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脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化
背景：脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点，通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得，但是存在着操作繁琐，花费高等不足。
目的：观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。
方法：无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织，组织块法分离培养脂肪源性干细胞，CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。
结果与结论：组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增，传代后以长梭形细胞生长为主，呈漩涡状排列，克隆样生长；经多次传代仍能保持较强的增殖能力，细胞生长曲线呈抛物线形；细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达，CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞，且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养，能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能，可以满足组织工程研究种子细胞的需求。 -
改良的软骨组织块培养法
为软骨的组织工程的临床应用寻求一种与之相适应的体外扩增种子细胞的方法. 将传统的组织块培养法进行改良,在置入培养皿前先以0.25%胰蛋白酶、0.08% EDTA及0.1%睾丸透明质酸酶消化软骨组织块(实验组),以传统的组织块培养法为对照组进行培养.结果:在培养的第3天,实验组贴壁率为88.89%(32/36),对照组为68.89%(23/36)(P＜0.05);培养后的第30天,实验组的细胞簇形成阳性率为100%(12/12),而对照组为0(0/12)(P＜0.01).结论:改良的软骨组织块培养法优于传统的组织块培养法,更适合于软骨的组织工程临床应用.
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大鼠脂肪干细胞两种培养方法的比较
目的 采用组织块培养法和胶原酶消化法体外培养大鼠脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),并对两种培养方法进行比较分析.方法 分离SD大鼠腹股沟处脂肪组织,分别采用组织块培养法和胶原酶消化法获取ADSCs,并对其进行原代培养和传代培养,观察细胞形态,比较细胞的产量和增殖能力;分别用化学成脂诱导剂和化学成骨诱导剂诱导ADSCs分化,观察其分化情况,并计算成脂量.结果 组织块培养法和胶原酶消化法培养ADSCs的成功率分别为79％和53％,获得的第4代ADSCs多为成纤维细胞样,长梭形或纺锤形,无形态学差异,传至第8代,细胞生长状态良好,传代后细胞性状均一,生物学特性稳定;培养第7天,组织块培养法每毫克脂肪组织获得的细胞产量高于胶原酶消化法,差异有统计学意义(P＜0.05);第4代ADSCs生长曲线均为相似的“S”型,细胞倍增时间分别为96.56和95.84 h;ADSCs均可向脂肪细胞和骨细胞方向分化,培养第7天,两组间成脂量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脂肪组织块培养法是更适合的体外获取ADSCs的方法.
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大鼠唾液腺细胞体外原代培养的一种新方法
目的:建立大鼠唾液腺上皮细胞体外原代培养模型,为体外研究唾液腺疾病提供种子细胞.方法:在无菌条件下取出生1～2 d的Wistar大鼠腮腺组织,手术显微镜下去除腺体包膜,以无血清培养基(kerotinocyte-SFM)为培养液,并添加表皮生长因子(rat epidermal growth factor,rEGF)、牛垂体提取物(bovine pituitary extract,BPE)、氢化可的松(hydrocortisone,HC)、转铁蛋白(transferrin,Tf)、胰岛素(insulin,INS)等因子,应用组织块培养法进行培养.用倒置相差显微镜观察培养细胞体外生长的形态特征.用H-E染色及细胞角蛋白、波形蛋白免疫组织化学染色对培养的细胞进行形态学检查和鉴定.结果:培养的腮腺上皮细胞为三角形、多边形、圆形、短梭形,细胞单层生长,连接疏松.H-E染色可见细胞多为圆形,核蓝染,细胞有突起、细胞间桥.细胞角蛋白染色阳性,证实所培养细胞为上皮来源;Vimentin、actin和calponin染色细胞大部分呈阳性,进一步确定细胞主要为肌上皮细胞.原代细胞在3～5 d内保持良好的生长状态,并存活1周左右.结论:组织块培养法可以简捷、快速地获得大鼠腮腺上皮细胞,成功建立Wistar大鼠腮腺上皮细胞的体外模型.
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乳腺癌细胞株两种原代培养方法的比较
目的 探讨乳腺癌细胞株原代培养的方法.方法 取“人乳腺-人乳腺”小鼠模型的乳腺癌原位灶,用组织块培养法和细胞培养法分别对其进行原代培养,并对两种培养方法的结果进行比较.结果 两种方法均能得到乳腺癌原代细胞,组织块培养法的成功率为90.0％,细胞培养法的成功率为20.0％.结论 组织块培养法是较好的原代培养方法.
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子宫内膜异位症腹膜红色病变组织块细胞培养法
目的:探索组织块细胞培养方法构建子宫内膜异位症(内异症)腹膜红色病变的细胞体外模型.方法:采用组织块培养法共培养12例腹膜红色病灶,同时以酶消化共培养法对2例在位子宫内膜进行细胞培养作为实验对照.进行抗角蛋白和波形蛋白以及抗Flt-1、KDR抗体的细胞免疫化学检测.结果:12份标本中8份培养成功,每75ml体积的培养瓶可得到(2～5)×106个腺细胞及间质细胞,与酶消化培养法子宫内膜组织细胞的形态相似,经细胞免疫化学验证细胞成分并进行了初步细胞学实验研究.结论:腹膜红色病变组织的组织块培养法可作为内异症早期病变的细胞体外模型之一.
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组织块培养法及酶消化法培养人角膜缘上皮细胞
角膜上皮的完整和无血管状态对维持角膜的生理功能和透明性十分重要.角膜上皮的完整性有赖于角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)的增生和分化,多种原因可造成LSCs的缺乏或功能障碍,使角膜丧失完整性和透明性.LSCs功能障碍有许多新疗法,其中角膜缘上皮细胞体外培养后移植成为研究热点.目前多数学者采用组织块法进行角膜缘上皮细胞的培养,培养体系中干细胞能否从在组织块中迁移出来尚有争议,而酶消化法越来越受重视.
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从脊柱内镜手术摘除组织中分离髓核间充质干细胞及其生物学特征鉴定
目的:利用经皮内镜下腰椎间盘切除术获取来源明确的髓核组织,结合组织块培养法高效分离培养人髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells,hNP-MSCs), 并鉴定其生物学特征.方法:收集6例腰间盘突出症手术摘除的髓核组织,利用组织块培养法分离培养.取第3~6代生长良好的细胞用于实验,采用CCK-8检测增殖能力;用流式细胞术检测细胞表面标志物;并分别向成骨、成脂和成软骨方向诱导分化,用油红O染色、茜素红染色及阿利新蓝染色对分化结果进行检测.结果:成功从椎间盘内镜摘除的髓核组织中分离培养具有增殖能力的细胞,流式细胞术检测显示细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD73和CD105等间充质干细胞抗原,不表达造血干细胞标志CD34和CD45.生长曲线显示符合正常间充质干细胞增殖特征.茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色均呈阳性,说明分离培养的细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的能力.结论:首次结合椎间盘内镜微创手术和组织块培养法,体外高效分离培养了具有自我更新能力和多向分化潜能的hNP-MSCs.
关键词： 经皮内镜下腰椎间盘切除术 组织块培养法 人髓核间充质干细胞
