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肾穿刺活检组织Masson染色的改良
目前,肾穿刺活检组织的固定方法仍多选择4％中性缓冲甲醛,用该方法固定的肾组织行PAS、PASM染色,能很好地显示肾小球、肾小管、肾间质、血管及特殊的蛋白沉积等,但在Masson染色时,经常会出现嗜复红蛋白不着色或染色很弱的现象.为了解决这个问题,本实验室采用4种方法进行比较,发现组织切片通过补充固定后,用胰酶消化,嗜复红蛋白能很好地显示,并定位准确、背景干净、颜色鲜艳,有助于临床病理诊断.
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两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较
背景:人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点.目的:寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法.方法:取5~10 周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7 和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定.结果与结论:两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形.抗-细胞角蛋白7 阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达.胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P < 0.05).提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法.
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人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定
背景：建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前，国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤，同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。
目的：探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。
方法：利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织，经两步酶消化法和非连续 Percol 密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。
结果与结论：实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞，原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁，第10天进入对数生长期，第12至13天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7 d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布。免疫荧光化学结果显示，培养的细胞中 FⅧ因子与 CD31相关抗原双荧光染色呈阳性，细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。结果证实，应用两步酶消化法、非连续 Percol 密度梯度离心法分离细胞，并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞，可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。 -
高效的多巴胺能神经元原代培养方法及其影响因素的研究
目的:建立一种简单高效的中脑多巴胺神经元细胞原代培养方法,并观察胰酶消化对中脑多巴胺能神经元突起生长的损伤作用.方法:以Nakai等经典神经元细胞原代培养方法为基础,通过使用低日龄胎鼠,初次培养液加入胎牛血清等步骤,促进中脑多巴胺能神经元细胞贴壁和生长;在无胰酶消化组直接使用内口外翻的小口径硅化吸管轻柔吹打离散细胞,比较两种方法间神经元细胞突起形成的差异.结果:接吹打组其多巴胺能神经元细胞突起的生长程度(212±10 μm)明显高于胰酶消化组(113±9 μm)(P＜0.01),而两组间多巴胺阳性细胞比例未见显著差异(P＞0.05).结论:在中脑多巴胺能神经元细胞原代培养中,低日龄胎鼠及免胰酶消化离散细胞可减少神经元细胞损伤,有利于细胞突起的生长.
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胰酶消化法纯化诱导不同年龄段SD大鼠骨髓破骨细胞的体外培养
目的 用胰酶消化法纯化获取大量高纯度破骨细胞,为进行相关分子生物学研究奠定基础.方法 以1,25-(OH)2D3/地塞米松诱导培养不同年龄段(1、12、24、36d)SD大鼠的骨髓破骨细胞,采用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸纯化.通过倒置相差显微镜观察细胞形态,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色和扫描电镜观察鉴定破骨细胞,并计数分析.结果 1、12、24、36 d组大鼠骨髓破骨细胞均培养成功,经Trap染色和扫描电镜观察证实为体外有噬骨能力的破骨细胞,纯化率达到90%.1 d和12d组破骨细胞出现较早且数量较多,细胞计数两组间无统计学差异((P＞0.05),但它们与其余各组均有统计学差异(P＜0.05).结论 采用胰酶消化法纯化1,25-(OH)2D3/地塞米松诱导培养的大鼠骨髓破骨细胞,纯度较高;选用大鼠以10-12 d龄较为适宜.
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胰酶消化时长对GFP转基因小鼠BMSC传代生长特性的影响
目的 比较胰酶消化时间对绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)传代生长、分化能力的影响.方法 取含相同细胞量的P2代绿色荧光蛋白转基因小鼠BMSC悬液接种于6孔细胞培养板中,待细胞生长融合度达到80％～90％时,用0.25％的胰酶消化5、10、15和20 min,比较不同时间点胰酶的消化能力、再次贴壁生长状态、培养上清中BMSC死亡碎片的数量以及诱导成脂、成骨、成软骨分化能力.结果 消化5 mins后,大量BMSC处于贴壁状态,无法传代;消化10、15 mins后,80％以上的BMSC缩成圆形并脱落,二次贴壁后呈长梭形,表面光滑,具有多向分化潜能;消化20 min后,BMSC全部悬浮,再贴壁后呈宽大扁平状,表面粗糙,培养上清中悬浮大量细胞死亡碎片.结论 绿色荧光蛋白转基因小鼠BMSC传代培养中,0.25％胰酶的佳消化时间为10～15 mins.
