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  • 大鼠血管外膜成纤维细胞的原代培养及生物学行为研究

    作者:鹿燕敏;李兰芳;霍海如;谭余庆

    目的:建立大鼠血管外膜成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的方法,并对其生物学特征进行观察.方法:通过组织块贴壁法,以含20%胎牛血清的DMEM诱导细胞生长,0.25%的胰酶消化细胞传代后用含10%胎牛血清的DMEM在37 ℃,5%CO2,饱和湿度下培养.倒置显微镜下观察成纤维细胞形态,进行细胞中间丝蛋白的免疫化学鉴定,并绘制细胞生长曲线.结果:成纤维细胞能够迅速从组织块长出并增殖,波形蛋白免疫细胞化学染色为阳性,结蛋白及第Ⅷ因子染色为阴性,细胞在第(2~4)天进入指数生长期.结论:该方法所获得的血管外膜成纤维细胞可在体外稳定培养,为在细胞水平研究血管再狭窄机制提供了充足可靠的靶细胞模型.

  • 细胞培养实验中细胞系鉴定及质量控制重要性探讨

    作者:张文丽;孔凡虹;贺文艳;李奇;李昊文;董成亚;刘丽;何露;王雅杰

    目的 以脑胶质瘤细胞系(U87)为例,探讨对在细胞培养实验中所使用的细胞系进行鉴定和质量控制的重要性.方法 对三株不同来源的U87细胞系进行STR分型检测,并结合显微镜下形态学特征,判断所测细胞系是否为真正的U87细胞系及是否发生交叉污染.结果 通过细胞STR分型结果与ATCC、DSMZ中STR数据库对比,得出U87-1细胞分型与ATCC中U-87 MG Glioblastoma-Astrocytoma Humanl00%匹配;U87-2细胞分型与DSMZ数据库中U-87MG100%匹配;U87-3未得到扩增产物,不能进行分型,原因是该细胞株为非人源细胞.结论 细胞培养实验中所使用细胞系的鉴定对于后续研究具有重要意义,可使用STR分型检测技术在细胞系培养过程中进行质量控制,对其进行准确鉴定,并排查是否存在细胞交叉污染.

  • 内皮祖细胞的体外培养

    作者:王琴;马可;仉红刚;张秋菊;修瑞娟

    目的 建立一个体外培养脐血来源内皮祖细胞(EPC)的培养体系.方法 脐带血经密度梯度离心获得单个核细胞,按本室已建立的培养体系培养细胞,免疫细胞化学和流式细胞术对培养7 d后的细胞进行CD34、CD133、vWF、CD146及CD144鉴定.结果 接种后前5 d为生长的潜伏期,细胞开始贴壁,无明显扩增.第6天平均每个视野下细胞数目为287±45;第9天细胞数为282±46;第12天开始,细胞进入对数生长期,细胞数为805±67(P<0.05);第19天细胞继续增殖,细胞数为1 115±182(P<0.05);第23天时,细胞进入凋亡期,数量明显减少,为265±61(P<0.05).vWF、CD146、CD144表达阳性.流式细胞术结果表明,梭形样细胞群体中,CD34阳性率为88.98%±5.15%(P<0.05),CD133阳性率为1.20%±1.44%(P<0.05).结论 利用本实验室的培养体系成功培养出内皮祖细胞.

  • 肝窦内皮细胞的分离培养及体外生长规律的观察

    作者:吕文良;徐晨光;张莎莎;杨佼;李娟梅

    目的:建立大鼠肝窦内皮细胞(SEC)的分离培养的方法,观察SEC体外培养的生长特点。方法通过门静脉插管进行胶原酶原位灌注,结合离体消化、Percoll密度梯度离心法分离SEC;应用Ⅷ因子和CD14间接免疫荧光法观察SEC表面分子的表达进行细胞鉴定;应用光学显微镜、电子显微镜、并首次使用原子力显微镜(AFM)观察体外培养状态下SEC的超微结构及形态学变化。结果 SEC获得率为每只大鼠(2.95±0.31)×107,细胞活力好。免疫荧光法鉴定CD14阳性率约达99%,Ⅷ因子相关抗原抗体阳性率约为2%。光学显微镜下观察,细胞形态变化典型,并持续增殖。电子显微镜下观察到细胞典型的由成簇窗孔组成的筛板样结构;AFM下实现了对SEC的三维结构的观察,细胞骨架清晰。结论高纯度、活力好的SEC的成功培养及体外生长规律的观察,为研究SEC在肝脏生理病理过程中作用提供了前提条件。

  • 免疫组化技术在原代培养细胞鉴定中的应用

    作者:范尔钟;王津津

    利用免疫组化技术对原代培养的细胞进行鉴定,已较广泛应用于科学研究中.

  • 人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定

    作者:刘晓丹;刘兵;李秀森;毛宁

    本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法.从正常产妇分娩后的胼带静脉灌注液分离间充质干细胞,观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期,在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化.结果表明:脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样,高表达CD29、HLA-ABC、CD166、CD105、CD73、CD44;不表达造血和内皮标志(CD34、CD45、CD144和CD14).它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化,符合间充质干细胞的基本功能特征.结论:人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞,能够在体外培养和扩增,可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞.

  • 兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

    作者:吴波;卢正茂;王尧;罗天航;薛绪潮;毕建威;康俊升;方国恩

    本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法.抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定.结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞.内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71 ±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61 ±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24 ±11.40)%.细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1.结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞.

  • 利用猪子宫三种体外培养细胞构建三维医学模型

    作者:王有柱;梁素丽;白修云;马月辉;关伟军

    目的 在体外培养出结构和功能与活体组织和器官相同或相似的结构功能体,以作为器官移植宝贵材料或其他生物现象的体外研究模型.方法 运用胰蛋白酶消化、细胞筛网法和组织块贴壁法分离构建三维医学模型所需的种子细胞,然后选择适宜的生物支架材料,后将种子细胞依照自然子宫结构附植在支架材料上,经体外培养而获得的与自然子宫形态与功能相似的模拟体.结果 本实验成功地建立了上皮细胞、基质细胞和平滑肌细胞的有限细胞系,并构建了猪子宫三种体外培养细胞三维医学模型.结论 运用胰蛋白酶消化、细胞筛网法和组织块贴壁法分离种子细胞是一种较好的方法,其分离结果细胞较纯.

  • 人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定

    作者:周丽;常青;李自成

    目的 体外建立一种简便的人脐静脉血内皮克隆形成细胞(ECFCs)分离培养方法,并对其进行鉴定.方法 无菌条件下收集脐静脉血,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNCs),诱导分化为ECFCs,倒置显微镜下观察其原代及传代培养细胞生长状况并通过流式细胞仪、免疫细胞化学、荧光双染色对ECFCs进行鉴定.结果 ECFCs培养过程可出现边界清楚的类圆形单层鹅卵石样细胞集落,细胞增殖能力强,连续传十几代细胞形态稳定,ECFCs高表达内皮系细胞表面抗原,而不表达造血系表面标记;可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1.结论 通过简单、可靠的实验方法获得了ECFCs,为进一步探讨其生物学功能及临床应用提供了基础.

  • 兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究

    作者:周晨阳;陈忠;辛毅;杨燎;王盛;唐小斌;成伟;刘丹

    目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法.方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs;在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况;采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达.结果:两种源性EPCs均于培养3~4d完全贴壁,呈克隆样生长,7 ~9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95%.两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似“s”形、MTT法显示3~5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48%和3.52%,骨髓源性EPCsG0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11%和1.84%.第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达.结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养.与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源.

  • 改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及细胞鉴定

    作者:刘勇军;王萍萍;马婕;欧阳彬;陈娟;管向东

    目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞的原代培养方法,并对所培养的原代细胞进行鉴定.方法 应用SD大鼠的外周肺组织,进行大鼠肺微血管内皮细胞的原代培养.从动物选取、取材、肺灌注、植块贴壁、培养基及添加物的选择等方面对肺微血管内皮细胞原代培养技术方法进行改进.从细胞形态学特征,免疫组织化学检测血管内皮细胞表面标志物(CD31抗原和Ⅷ因子相关抗原的表达),荧光显微镜观察异硫氰酸荧光标记植物凝集素与肺微血管内皮细胞特异性结合情况等方面鉴定所培养的肺微血管内皮细胞.流式细胞仪检测细胞纯度,噻唑蓝测量细胞生长曲线.结果 原代培养肺微血管内皮细胞成多角形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样生长,传代培养后可变为梭形呈漩涡样生长或聚集生长.免疫组织化学显示细胞CD31和Ⅷ因子相关抗原的表达阳性;异硫氰酸荧光标记植物凝集素结合试验阳性.细胞生长状态良好、细胞纯度达93.2%.结论 改进后的原代培养方法简便、可靠,获得的肺微血管内皮细胞污染少、纯度高,状态良好,保持了内皮细胞的结构和特性.

  • 新生小鼠视网膜光感受器前体细胞的体外培养及鉴定

    作者:石芊;彭秀军

    目的 对新生小鼠视网膜光感受器前体细胞进行分离和鉴定.方法同窝新生小鼠14只,随机分为7组(P1-P7),每组2只,出生后连续7d每天取1组幼鼠,分离视网膜并进行体外培养,观察其生长状况.传代后培养2周,然后采用细胞荧光免疫组化法检测细胞中的5-溴-2'脱氧尿嘧啶(BrdU)、细胞神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、神经视网膜亮氨酸拉链(Nrl)和视蛋白(Opsin)的表达情况,并对视网膜光感受器前体细胞性质进行分析.结果 在特定的培养基中,部分P1-P7各组新生小鼠视网膜细胞贴壁生长,荧光免疫组化标记显示传代后生长细胞大部分为BrdU阳性细胞.P1-P7组Nestin阳性率分别为31.0%、31.6%、32.3%、30.2%、31.2%、30.9%、29.5%.Nrl阳性细胞数出生后3d开始明显增多,随后小幅增加,P1-P7组阳性率分别20.6%、35.2%、65.5%、68.6%、71.6%、73.O%、73.3%.P1-P4组细胞不表达Opsin,P5-P7组少量细胞表达Opsin.结论 新生小鼠视网膜存在视网膜光感受器前体细胞,该细胞具有分裂增殖能力及向视网膜光感受器细胞分化和表达视蛋白的潜能,并于生后3d明显增多,此后逐渐分化为成熟的光感受器细胞.

  • 应用自制谱细胞鉴定不规则抗体技术的探讨

    作者:尚伟涛

    鹤岗地区输血患者每年大概在1500例,含有不规则抗体的大概有几十例,无偿献血者大约有20例左右,这些病例都得经过谱细胞鉴定诊断.应用活谱细胞这项技术后,此类抗体的检查可作为常规实验.随着聚凝胺配血法的推广,不规则抗体检出率也日益增高,应用谱细胞筛选不规则抗体的性质,为临床的疑难用血提供了筛选方法,及时的找到相合的血液,HDN的发病率在鹤岗也日趋增高.产前的预防和产后的治疗也逐渐重要,应用活谱细胞的筛选方法,可对HDN的产前预防和产后治疗提供科学诊断依据.

  • 骨巨细胞瘤肿瘤性细胞鉴定凋亡检测与预后关系的研究

    作者:赵法章;吴晶涛;马秋野;黄磊;段晓东;孔令员;李英淑

    巨细胞瘤是常见的原发性骨肿瘤之一,其发生率占全部骨肿瘤的20%,中国人发生率是欧美的3倍.该肿瘤介于良恶性之间,但局部侵袭性强,主要表现为溶骨性病变,部分良性骨巨细胞瘤可发生远处转移,具有潜在恶性,常规手术治疗复发率高.

  • 大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究

    作者:史慧敏;徐军全;王登妮;王明亮;宋彬妤

    目的:探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件.方法:采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心(20 000 r/min)和细胞悬液低速离心(40× g)去杂质后得到肝星状细胞.台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度.结果:肝星状细胞的得率为(3.6±0.1)×107/肝,肝星状细胞存活率为(92.8±0.8)%,对培养24 h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为(96.2±0.5)%.结论:本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究.

  • 抗-Jkb引起交叉配血困难1例

    作者:冯天华;赵长霞;陈艳平;汪淑华;史欣蕾

    抗-Jkb是 kidd 血型系统的抗体之一,常常是通过输血、妊娠等免疫刺激产生。近日,我院输血科发现1例老年男性抗体筛查结果阳性,经谱细胞鉴定为IgG抗-Jkb抗体,现报道如下。

  • 大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养鉴定和体外分化特点

    作者:冯永强;李峥;褚万立;郁永辉;马丽;柴家科

    目的 建立骨骼肌卫星细胞(SMSC)的体外分离、原代培养、鉴定方法,观察细胞的成肌分化特点.方法 采用组织块法结合差速贴壁法获得SMSC.采用免疫荧光和流式细胞仪以Pax7为标志物鉴定分离获得的卫星细胞纯度,用分化培养基诱导SMSC的体外分化,实时定量PCR法检测分化标志基因成肌决定因子(MyoD)和生肌素的mRNA相对表达量.结果 组织块法培养约1周,可见细胞从组织块边缘爬出.经差速贴壁法纯化后,流式细胞仪检测所获得的原代SMSC纯度可达97.6%.细胞体外诱导分化后,MyoD和生肌素基因呈时序性表达.结论 组织块法可成功获得高纯度的SMSC,在体外具有良好的分化能力.

  • 大鼠海马神经元的原代培养及细胞鉴定

    作者:王翀;赵康峰;顾雯;李玲;张宏伟;白雪涛

    目的 建立一种大鼠海马神经元的分离及原代培养方法,并进行细胞鉴定来确定其特质性,为进行海马神经元的体外研究提供技术支持.方法 选用出生24h内的Wistar大鼠,分离双侧海马,经胰酶消化后用含10%马血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养,12h内换成无血清培养基培养48 h,加入阿糖胞苷处理24h,第5~8天用免疫组织化学法鉴定微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.结果 接种4h后细胞开始贴壁,有的长出细小突起,胶质细胞生长活跃,换为无血清培养及阿糖胞苷处理后胶质细胞生长抑制,海马神经元生长占优势,随着培养时间的增加,细胞突起逐渐增长及网状联络密集.培养至3周细胞逐渐死亡.MAP-2鉴定表达阳性.结论 出生24 h内的乳鼠原代海马神经元的分离及培养方法可靠,可作为神经元体外培养的良好模型,为体外研究提供可靠的技术支持.

  • 大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离及鉴定

    作者:张金卷;杜智;李涛;朱争艳;王毅军;聂福华;宋继昌

    目的建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,并探索其分离及鉴定方法.方法雄性Wistar大鼠每天1次连续灌胃给予不同剂量二乙酰氨基芴(2-AAF,5、10、15、20、25 mg/kg BW),第5天行标准的2/3肝切除术,术后按各自剂量继续给予11天,不同时间取肝脏组织,行甲胎蛋白、细胞角蛋白18及19染色并观察.以确定的2-AAF佳剂量制备大鼠肝干细胞增殖模型,Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化大鼠肝卵圆细胞,光镜、电镜下观察细胞特点,并进行上述细胞表型标志免疫组化染色.结果2-AAF 15 mg/kg BW能建立较理想的肝卵圆细胞增殖模型.HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量增殖的嗜碱性小细胞,电镜下观察此种细胞具有卵圆形细胞核、细胞质少而淡、核/浆比例较大等特点,免疫组化染色证实甲胎蛋白、细胞角蛋白18和19染色阳性,白蛋白及白细胞共同抗原(LCA)染色阴性.分离所得底层细胞,光镜下表现大小不等、不规则圆形细胞,体积较小,细胞核/浆比例较大,电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,余同增殖细胞特点,免疫组化染色与增殖细胞表现相同细胞表型特点.结论本方法可成功诱导、分离、纯化大鼠肝卵圆细胞,符合肝卵圆细胞的形态特点、超微结构及细胞表型标志特点.

  • 人胎儿肝干细胞分离鉴定及体内移植

    作者:张金卷;杜智;李涛;朱争艳;高英堂;王毅军;聂福华;宋继昌

    目的分离鉴定人胎儿肝干细胞,并观察其对急性肝损伤严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠进行异种移植的治疗效果.方法以改进Seglen胶原酶(Ⅳ型)原位灌注结合Percoll密度梯度离心法分离纯化要求终止中期妊娠而流产的男性胎儿肝干细胞,经光镜、电镜下观察细胞特点,进行肝干细胞细胞标志SABC免疫组化染色.经肝脏直接注射移植人胎儿肝干细胞(106细胞)以治疗D-氨基半乳糖(800mg/kg)诱发的急性肝损伤雌性SCID小鼠,于移植前及移植后24、48、72 h、1周取血测定ALT、TBiL,于移植后1、2、4周取受体肝脏组织,PCR方法检测受体肝组织性别决定因子.结果人胎儿肝干细胞平均细胞产量(2.10±0.50)×107,细胞活性率为(92.30±1.23)%;光镜下呈游离状态、大小不等的单个细胞,约为正常肝细胞1/5~1/3大小;电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,卵圆形细胞核,核/浆比例较大等特点;甲胎蛋白、细胞角蛋白8、19及α-1-抗胰蛋白酶免疫组化染色呈阳性,白蛋白及白细胞共同抗原染色呈阴性表现,培养3周可形成克隆样结构.人胎儿肝干细胞移植组急性肝损伤SCID小鼠移植24h后血清ALT、TBiL水平降低,各时间点均低于对照组(P<0.05),且肝脏病理损伤逐渐减轻;存活2周小鼠肝脏组织中PCR测定性别决定因子呈阳性表达,随时间延长表达增强.结论该方法能成功分离高产量、高活性人胎儿肝干细胞,在急性肝损伤SCID小鼠体内移植存活,并改善其肝功能、肝脏病理指标.

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