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壳聚糖复合共混膜培养兔角膜缘上皮及其移植
目的探讨壳聚糖、胶原、透明质酸钠复合共混膜作为兔角膜缘上皮细胞体外培养载体及其自体移植的可行性.方法活体取兔左眼角膜缘浅层小块,置此共混膜上,常规培养8天.将兔右眼角膜浅层基质分离成囊袋,用3mm环钻去除角膜中央浅表层,将含培养角膜缘上皮细胞的共混膜植入自体角膜囊袋内(6只兔),对照组则植入不含细胞的共混膜(6只兔).术后观察1月.结果角膜缘小块在共混膜上培养生长良好,移植手术后40h,实验组5/6角膜植片荧光素染色阴性;对照组术后4天角膜植片荧光素染色仍为部分阳性.实验组组织学检查显示材料表层上皮完整,AE1/AE3免疫组化染色阳性,材料部分降解.结论壳聚糖胶原透明质酸钠共混膜可作为培养角膜缘上皮细胞及其移植的载体.
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羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗
目的探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损.方法在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月.其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气-液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损.进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察.结果角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固.实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点.但眼睑闭合不全可导致手术失败.对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变.结论以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变.
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不同体外方法培养兔角膜缘上皮细胞作用的研究
自从1986年Schermer等[1]发现角膜缘干细胞位于角膜缘基底Vogt栅栏内后,对角膜缘干细胞缺失和角膜上皮病变治疗有了许多新的疗法,其中以角膜缘上皮细胞体外培养法治疗上述疾病比较有效.目前,多数学者采用组织块法进行角膜缘上皮细胞体外培养,但在培养系中干细胞能否从组织块中迁移出来尚有争议.
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超低温(-196 ℃)保存角膜缘上皮细胞的生物活性研究
目的探讨不同的低温冷冻条件对角膜缘上皮细胞生物活性的影响.方法采用不同浓度梯度的二甲基亚砜和不同的降温速率保存兔角膜缘上皮组织;以台盼蓝染色方法计数角膜缘表层上皮细胞的存活率;通过体外细胞培养方法观察低温保存的角膜缘上皮细胞生长情况,并采用若丹明B染色法对原代细胞的增殖能力进行定量测定;将低温保存带有角膜缘的角膜进行器官培养,采用SABC免疫组织化学染色法检测角膜缘上皮细胞的PCNA表达.结果二甲基亚砜浓度梯度对低温保存的角膜缘表层上皮细胞存活率有显著影响,程序降温的效果明显优于非程序降温.体外细胞培养显示,二甲基亚砜浓度梯度和降温方法对角膜缘上皮细胞增殖能力无显著性影响(P＞0.05);血清培养组优于无血清培养组(P＜0.05,P＜0.01).器官培养1周时,低温保存的角膜缘上皮细胞核中均可见PCNA表达,染色阳性细胞主要在基底细胞层.结论角膜缘干细胞具有较强血清依赖性和低温耐受性,提示超低温保存角膜缘上皮具有可行性.
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角膜缘上皮细胞移植重建眼表的实验研究
目的 探讨角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮植片重建眼表的可行性和有效性.方法 采用碱烧伤法建立完全性角膜缘干细胞缺陷的SD大鼠动物模型,以羊膜为载体培养人角膜缘上皮细胞,移植重建角膜缘干细胞缺陷眼表,观察术后眼表状态的改变,RT-PCR和免疫组化检测术后10、20、30、45 d及60d角膜组织CK3/12和P63的表达.结果 体外培养的人角膜缘上皮细胞移植术后,完全性角膜缘干细胞缺陷眼表状态较术前和对照组都有不同程度改善；免疫组化和RT-PCR检测表明体外培养角膜缘上皮细胞移植术后角膜组织60d内P63和CK3/12表达无明显改变.结论 以去上皮羊膜为载体,体外培养人角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮植片能够重建完全性角膜缘干细胞缺陷眼表.
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兔角膜缘上皮细胞培养联合羊膜行自体移植的实验研究
目的:用体外培养的角膜缘上皮细胞联合人羊膜的方法,行自体移植治疗角膜缘干细胞完全缺乏的兔眼.方法:制作10只兔右眼干细胞缺乏的模型,取其中7只兔的左眼上方角膜缘取一小块组织进行体外培养,并传代在无上皮细胞的人羊膜上.1个月后,手术切除10只兔受伤眼角膜表面被覆的新生血管膜和结膜上皮,7眼接受了含自体培养上皮细胞的羊膜移植,另3眼仅移植无上皮细胞的羊膜.结果:l周后原代培养的角膜缘上皮细胞融合,传代至无上皮细胞的人羊膜上继续生长2～3周,角膜上皮细胞可牢固的附着于羊膜上.移植了含有角膜上皮细胞的羊膜的兔子,术后早期都形成了角膜上皮化,并明显抑制了新生血管的再生,而接受羊膜移植的兔子,术后又出现明显的新生血管.结论:利用无上皮细胞的羊膜作为载体,培养角膜缘上皮细胞并自体移植可以恢复角膜上皮化、抑制新生血管生长.
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培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究
目的 探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果.方法 将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出.将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质.通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性.结果 AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7 d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P＜0.05,但培养5 d后无显著差异(P＞0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P＜0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P＞0.05).结论 冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似.
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异体角膜缘上皮细胞培养后移植的实验研究
目的 观察含培养的角膜缘上皮细胞的羊膜片移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上的效果.方法 把羊膜为载体组织块培养的角膜缘上皮细胞移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上,术后观察角膜混浊度、角膜新生血管、角膜上皮等情况,定期兔进行病理组织学检查.结果 角膜缘上皮细胞在羊膜上培养16 d形成3～4层,用含有培养的异体角膜上皮细胞的羊膜片移植的12只兔眼,术后第5天,损伤的角膜表面全部上皮化,第16天开始,12只兔眼逐渐出现排斥反应.结论 含培养的角膜缘上皮细胞羊膜片异体移植术后早期角膜全部上皮化,晚期则出现排斥反应.
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以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究
目的 建立以免去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法,观察细胞生物学特性.方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上.每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原(anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA)单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测.结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层.传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层.细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应.结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞.
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组织工程角膜上皮治疗兔角膜缘干细胞缺损的实验研究
制作兔眼(右眼为实验眼)角膜缘干细胞完全缺损模型,随机分为实验组和对照组.实验组取对侧眼角膜缘组织,以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体制成组织工程角膜上皮,培养后12 d行角膜缘干细胞羊膜移植术;对照组行单纯羊膜移植术(仅刮除上皮的羊膜).实验组角膜缘干细胞移植术后,兔角膜上皮逐渐愈合,透明度提高,基质细胞浸润减轻,新生血管减退或消失;印迹细胞学检查显示,移植前角膜上皮细胞PAS(+),而移植后PAS(-).认为以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞,可于体外重建组织工程角膜上皮组织,移植后可修复角膜缘干细胞缺损.
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以纤维蛋白凝胶为载体培养兔角膜缘上皮细胞
目的 研究兔角膜缘上皮细胞(corneal limbus epithelial cell,CLEC)在纤维蛋白凝胶上的佳接种方式及其生长情况.方法 取角膜缘上皮组织块进行细胞培养.用针对鼠抗兔角蛋白3(CK3)的单克隆抗体AE5和抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体行间接免疫荧光鉴定.MTT法测定CLEC增殖活性.将传第二代的细胞分A、B两组分别接种到纤维蛋白凝胶表面和凝胶体内进行培养,在接种后5d、10 d、15 d时将凝胶溶解离心后计数细胞数,比较两种接种方式下细胞的增殖力.结果 传第一、二代细胞培养3～5d后胞浆AE5染色阳性,胞核PCNA染色阳性,传第一代阳性细胞比例分别为31％、65％,传第二代阳性细胞比例分别为45％、79％.传第一代细胞在接种后6h内贴壁,1～2d时处于潜伏期,2～3 d时处于快速生长期,3d时达85％以上汇合,细胞增殖活性高,4d时细胞汇合达95％以上,增殖活性逐渐降低.接种后5d时A组细胞数低于B组,差异有统计学意义(P＜0.05)；10d和15 d时A组细胞数均高于B组,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).结论 以纤维蛋白凝胶为载体培养CLEC时将细胞接种在凝胶表面比包埋在凝胶体内更有利于细胞增殖,适合用于CLEC移植培养的研究.
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羊膜为底物角膜缘上皮细胞培养方法的探讨
目的探讨在羊膜上培养角膜缘上皮细胞(limbal epithelial cells,LEC)的合适方法.方法切取大小约2mm×2mm、厚约200μm含有完整上皮细胞的兔角膜缘组织,剪切成4个1mm×1mm小的组织块,以羊膜为底物分别使用组织块培养法、组织块培养后传代培养法和组织块经消化酶处理后培养法培养兔LEC,通过倒置显微镜、细胞组织学和扫描电镜观察细胞生长情况.结果使用上述3种方法培养的LEC均可在羊膜上形成密集单层.细胞组织学检查显示在羊膜上培养的LEC尚可形成多层.扫描电镜观察LEC立体感强、细胞表面微绒毛丰富.但以组织块经消化酶处理后培养法培养LEC较为快速.结论在羊膜上上述3种方法都可用于LEC的培养,但以组织块经消化酶处理后培养法更为实用.
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荧光激活细胞分离技术在角膜缘干细胞研究中的应用
目的 探讨荧光激活细胞分离技术(FACS)在体外培养的兔角膜缘上皮细胞生物学特性研究中的应用.方法 收集新西兰白兔的角膜缘组织进行组织块培养.采用FACS分离出体外培养的兔角膜缘上皮细胞中的侧群(SP)细胞和非SP细胞.用2%锥虫蓝染色法对分离出的SP细胞进行克隆形成率(CFE)检测以评估SP细胞的活性,用免疫组织化学染色检测 K3/12和ABCG2蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达.结果 SP细胞在体外培养的兔角膜缘上皮细胞中占(0.22±0.09)%,分离出的SP细胞的CFE为(5.52±0.45)%,而非SP细胞为(0.78±0.73)%,二者差异有统计学意义(t＝2.17,P<0.01);大部分SP细胞呈K3/K12抗原阴性,ABCG2免疫标记呈阳性;而非SP细胞呈K3/K12抗原阳性,ABCG2免疫标记呈阴性.结论 FACS可以应用于体外培养的兔角膜缘上皮细胞的SP细胞分离,分离出的SP细胞具有较强的增生能力.
关键词： 角膜缘上皮细胞 荧光激活细胞分离技术 侧群细胞 ABCG2 K3/K12 -
角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究
目的建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法.方法兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养.取第三代细胞进行冻存.于冻存后第2周,3、6个月复苏细胞.用MTT法测细胞生长曲线.结果兔角膜缘上皮细胞体外生长良好.培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性.冻存细胞复苏成功.冻存细胞复苏后生长曲线良好.结论兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏.
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体外培养的角膜缘上皮细胞生物学特性
目的观察体外培养的角膜缘上皮细胞生物学特性.方法体外组织块培养兔角膜缘上皮细胞,倒置显微镜观察活细胞生长情况,透射电镜观察其超微结构,用流式细胞仪检测细胞的增殖能力,使用MTT方法绘制传代细胞的生长曲线.结果角膜缘组织块培养第6d培养的角膜缘上皮细胞形成单层,培养的细胞具有代谢旺盛和较高的增殖能力,传代的角膜缘上皮细胞在第4d达生长高峰.结论体外培养的第1、2代角膜缘上皮细胞既保持角膜上皮特性,又具有强的增殖能力.
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角膜缘上皮细胞与脱细胞角膜材料移植修复碱烧伤角膜的实验研究
目的 探讨应用角膜缘上皮细胞(limbal epithelial cells,LECs)及脱细胞角膜材料(decellularized porcine cornea,DPC)移植修复碱烧伤兔角膜的疗效.方法 培养同种异体兔LECs,鉴定其中的角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),制备DPC作为支架材料,将LECs和DPC两者复合培养后板层移植到碱烧伤的兔眼角膜,观察移植后4个月内的角膜修复情况.结果 免疫细胞化学及RT-PCR检测培养的LECs中有表达ABCG2的LSCs.大体观察LECs-DPC移植后碱烧伤角膜的混浊度减轻,新生血管消退.HE、Masson Trichrome染色显示移植后上皮面的细胞复层化生长,炎性细胞浸润减少,DPC纤维整合于碱烧伤的角膜植床,角膜胶原排列趋于规则.透射电镜检查有桥粒及微绒毛结构形成.结论 体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞联合脱细胞角膜材料移植能够修复碱烧伤的兔眼角膜.
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兔角膜缘上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究
研究兔角膜缘上皮细胞(含干细胞)在完整羊膜和去上皮羊膜上种植及生物学特征,探讨组织工程技术体外重建角膜上皮良好的方式和方法.将兔角膜缘上皮细胞分别种植于去上皮羊膜基底膜和完整羊膜上进行体外培养扩增.从倒置显微镜下的生长特性、光镜下的组织结构、超微结构、免疫组织化学检测等方面对培养获得的复合组织进行观察.结果表明兔角膜缘上皮细胞在完整羊膜上不易贴壁、生长缓慢、很难汇合成片.而在去上皮羊膜上细胞能黏附生长并增殖形成由羊膜基底膜和4～5层上皮细胞组成的复合组织,基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接,细胞之间可见桥粒连接,细胞表达角蛋白3.该复合物可作为组织工程化角膜上皮组织.
