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供体因素对人角膜缘干细胞培养影响的研究
目的观察供体年龄及角膜新鲜程度对人角膜缘干细胞体外培养的影响.方法168例人角膜,按年龄分为A、B、C三组:按供体死亡至被培养的时间分为新鲜组和陈旧组.采用组织块培养法进行细胞培养,观察各组细胞开始生长时间及培养生长率.结果细胞开始生长时间及培养生长率在不同年龄组之间差异无显著性意义;但在较新鲜组与陈旧组之间差异有显著性意义;组织越新鲜,细胞生长越快,生长率越高.结论选取较新鲜的供体(≤8天)进行培养可获得好的培养效果,而不需过多考虑年龄因素.
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原子力显微镜在平板离心法筛选的人角膜缘上皮细胞研究中的应用
目的 用原子力显微镜研究平板离心法筛选出的三群角膜缘上皮细胞,确定细胞的类型.方法 用人角膜缘组织块培养法原代培养出角膜缘上皮细胞,收获细胞后将细胞置于未包被的六孔板上1400 r·min-和1800 r·min-1进行离心分群.ATC1为1400r·min-离心后贴壁的细胞,ATC2为1 800r·min-1离心后贴壁的细胞,NAC为1 800r·min -1离心后漂浮而不能贴壁的细胞.用BrdU标记延迟实验和原子力显微镜来分析这三群细胞.结果 在三群细胞中ATC1几乎全被BrdU标记延迟,占分选前总体细胞的10.14％±1.21％.原子力显微镜显示ATC1、ATC2和NAC的细胞形态和细胞膜表面有显著的差异.整体细胞粗糙度在ATC1、ATC2和NAC中分别为(20.91±1.42)nm、(80.37±3.43) nm和(102.94±4.52)nm,核部位膜的粗糙度分别为(33.79±1.66)nm、(13.12±0.79) nm和(8.48±0.64)nm.结论 原子力显微镜是一种非常好的区分和观察三群细胞的方法.BrdU标记延迟实验和原子力显微镜分析参数表明ATC1、ATC2和NAC可能分别为角膜缘干细胞、短暂扩充细胞和终末分化细胞.
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体外诱导人骨髓间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的初步研究
目的 探讨在体外损伤微环境下,人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性. 方法体外分离培养人MSCs和人角膜缘干细胞(LSCs),检测细胞CD34、CD44、细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白19(CK19)的表达情况.制作人LSCs热损伤模型,加入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的人MSCs共同培养,2周后检测细胞CK19的表达情况.结果 人MSCs CD44表达阳性、CD34表达阴性,流式细胞术显示CD44阳性率为92.59%,CD34阳性率为0.01%;人LSCs CK19表达阳性,CK3表达阴性.共同培养后部分人MSCs CK19表达阳性,并有多核细胞现象.结论 在损伤微环境下,人MSCs可以转化为类角膜上皮细胞的细胞,在此过程中存在细胞融合现象.
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人角膜缘干细胞在体外不同载体上培养的实验研究
目的寻找人角膜缘干细胞体外培养的载体.方法人角膜缘干细胞原代培养单细胞层传代到羊膜、卵壳膜、聚乳酸膜、藻酸盐凝胶4种载体和6孔培养板中,倒置显微镜观察、记录细胞生长情况.对6孔板传代细胞行生物特性检测,对载体上培养细胞行组织学检测.结果 6孔板中传代细胞对AE-5,4 G10,3表达阳性.羊膜、卵壳膜和聚乳酸膜上有细胞生长,7天左右形成单层;藻酸盐凝胶载体上未见细胞生长.结论传代细胞具有角膜缘干细胞生物特性;羊膜、卵壳膜和聚乳酸膜适合角膜缘干细胞传代培养.
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miR-31调控人角膜缘干细胞自我更新和分化的机制研究
目的 探讨microRNA-31(miR-31)对在胚胎干细胞微环境中培养的角膜缘干细胞(LSCs)自我更新与分化的调控作用.方法 采用CnT-20,添加20％胚胎干细胞培养上清液(ESC-C M),对LSCs进行培养.将ESC-CM组细胞进行转染miR-31或者Antago-31,检测细胞克隆形成能力的改变;流式细胞仪分析细胞周期、凋亡的改变,qPCR检测FIH-1、P21、P63、ABCG2、CK3、miR-31、miR-143、miR-145、miR-184的表达情况;免疫荧光与Western blot检测CK3、Cx43 P63、ABCG2、Survivin、FIH-1、P21、Caspase-3等的表达情况.结果 miR-31 mimic组细胞的CFE明显低于miR-31 inhibitor组[(3.00±1.00)％ vs.(6.90±0.79％),P＜0.05];Antago-31组细胞的CFE[(8.90±0.53)％ vs.(7.27±0.80),P＜0.05]则显著高于Ir-antago组.miR-31mimic组进入S期细胞的比例[(9.33±2.88)％ vs.(16.00±1.73)％,P＜0.05]明显低于miR-31 inhibitor组;Antago-31组进入S期细胞的比例[(22.33±2.58)％ vs(15.33±0.58)％,P＜0.05]则显著高于Ir-antago组.miR-31mimic 组细胞凋亡的比例[(31.13±7.56)％ vs.(4.83±0.38％),P＜0.05]明显高于miR-31 inhibitor组;Antago-31组细胞凋亡的比例[(3.03±0.23)％vs.(5.93±1.53％),P＜0.05]则显著低于Ir-antago组.在进行miR-31 mimc 处理之后,P63、ABCG2、Survivin、FIH-1、miR-143、miR-145的表达量下降,而P21、Cx-43、CK3、miR-31、miR-184的表达量明显上升(P＜0.05).在antago-31处理组,P63、ABCG2、Survivin、FIH-1、miR-143、miR-145的表达量上升,而P21、Cx-43、CK3、miR-31、miR-184的表达量明显下降(P＜0.05).Caspase-3的表达水平在antago-31处理组一直维持在相对较低的水平.结论通过转染Antago-31提高了FIH-1在LSCs中的表达水平,并减少了P21的表达.miR-31表达水平的下调促进了LSCs干性的维持.ESC-CM通过抑制miR-31/FIH-1/P21部分调控了LSCs的更新与分化.
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pEGFP-bFGF基因转染人角膜缘干细胞的实验研究
本研究体外培养并用抗角质蛋白K3/K12鼠单抗(AE5)鉴定人角膜缘干细胞(HLSCs),采用脂质体转染法将pEGFP-bFGF基因转染培养的HLSCs,48 h后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光,基因转染率为20%～30%,同时制作NaOH细胞损伤模型,研究转染后的细胞对损伤的抵抗作用,转染后损伤的细胞存活状况高于未转染损伤组(P＜0.05),而细胞凋亡及坏死率明显低于未转染损伤组(P＜0.05).pEGFP-bFGF基因能够转染培养的HLSCs,其表达产物对碱损伤的HLSCs具有保护作用,初步探讨了基因工程联合组织工程技术治疗眼表疾病的可行性.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 人角膜缘干细胞 基因转染
