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CM-DiI标记在小鼠骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死中的示踪研究
目的 探讨CM-Dil标记小鼠骨骼肌卫星细胞后移植治疗心肌梗死的体外体内示踪作用.方法 CM-Dil标记纯后小鼠骨骼肌卫星细胞,检测标记率及荧光情况,观察CM-Dil对细胞增殖分化的影响.小鼠心梗模型心肌内注射标记后的卫星细胞,于移植后1、3、7、14,21、28天取出心脏行冰冻切片,观察移植细胞在体存活分化情况.结果 CM-Dil标记骨骼肌卫星细胞效率达(93.3±0.95)％,3代后仍保持红色荧光,对细胞增殖及分化无明显影响.标记细胞移植1无后即可见细胞团聚,3天后细胞排列整齐,4周后仍可见移植细胞.结论 CM-Dil细胞标记液标记骨骼肌卫星细胞,安全简单,并可示踪移植后细胞的存活分化情况.
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细胞高浓度磁性标记导致细胞外大量纳米颗粒聚集物的形成
细胞移植在修复和替代受损器官、改善组织功能和基因治疗方面具有重要作用.活体细胞示踪是分子影像学的任务之一[1],能够实时监测移植细胞靶向迁移、迁移速度以及细胞在靶器官停留时间,有助于指导细胞移植技术在临床的合理应用.MRI具有组织和空间分辨率高、无放射损伤等优点,成为活体细胞示踪的重要研究手段.
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间充质干细胞组织特异性归巢的研究进展
间充质干细胞(MSCs)是一种非造血组织的多能干细胞,具有自我更新和多向分化的潜能,在机体组织再生和炎症控制的过程中发挥关键作用.其中,以MSCs为基础的治疗,其疗效至少部分取决于对所需细胞部位的特定归巢.然而,近许多研究发现MSCs对不同组织的归巢特性存在差异,在一定程度上影响了MSCs发挥治疗作用.因此本文对MSCs在骨髓、脾和淋巴结、肠、心脏、肿瘤、多脏器的归巢现象和治疗作用、归巢的影响因素以及体内示踪技术进行了综述.
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胶质瘤干细胞的生存微环境及其示踪研究进展
胶质瘤干细胞在胶质瘤的形成和生长中发挥至关重要的作用.胶质瘤干细胞的生存微环境是维持干细胞特性的关键,在体无创性示踪为研究胶质瘤干细胞的生存、繁殖、自我更新等特性以及促进胶质瘤发展的机制具有重要意义.
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内源性神经干细胞示踪的研究现状
内源性神经干细胞在中枢神经系统疾病的治疗中具有广阔的前景.目前免疫组织化学技术对内源性神经干细胞进行示踪主要是依靠检测细胞增殖标记物、外源性基因及免疫标志物,其具有有创性和取材的毁损性,不能应用于活体.以MRI、PET及SPET为基础的分子影像学技术逐渐应用于外源性干细胞示踪方面,弥补了常规组织学方法 的不足,可以进行活体、无创性示踪,但对内源性神经干细胞的活体示踪尚存在困难.现综述目前常用的内源性神经干细胞的组织学及影像学示踪方法 .
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SPIO在非吞噬细胞成像中的应用及研究进展
超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒作为MRI对比剂在医学领域发挥着越来越重要的作用.以SPIO结合MRI为基础的细胞示踪是一种较新的无创性的活体内细胞检测技术,它的独特优势使其成为干细胞移植、肿瘤血管生成、免疫细胞分布监测等方面的研究热点.就SPIO在非乔噬细胞标记和示踪研究方面的进展予以综述.
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干细胞标记示踪技术的研究进展
干细胞是一类具有多向分化潜能的特殊细胞,伴随着对其研究的深入,干细胞的临床应用前景也越来越广阔.但干细胞移植后,如何从宿主辨别移植细胞,并观察其在体内的生存和转归情况,一直是让人困扰的问题,采用有效的技术来标记和示踪干细胞移植治疗的效果将对其在动物实验研究和临床应用上起到促进作用.对干细胞标记示踪技术的研究进展予以综述.
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载氧化铁PLGA微粒标记肌腱干细胞的磁共振/光声示踪的实验研究
目的 探讨载氧化铁聚乳酸羟基乙酸微粒(PLGA/IO MPs)标记肌腱干细胞(TSCs)的效率及磁共振(MR)/光声(PA)成像双模态体内示踪 TSCs的可行性.方法 利用前期制备的PLGA/IO MPs与前期实验分离培养的TSCs共同孵育以标记 TSCs ;于标记后3 、 7 、 14 、 21和28 d对标记TSCs分别进行MR/PA成像及普鲁士蓝染色,应用电感耦合离子体原子发射光谱法(ICP-OES)测量标记TSCs细胞内Fe浓度.使用外科手术方式建立SD大鼠右侧肩袖损伤模型并移植标记 TSCs ,移植后第3 、 7 、 14 、 21和28 d对大鼠肩袖进行MR/PA双模态成像观察标记TSCs .结果 随着标记时间的延长,标记TSCs的MR和PA信号逐渐减弱,细胞内Fe含量逐渐减低,至标记后第28 d细胞内Fe含量与未标记TSCs差异无统计学意义(1 .45 pg Fe/cell对1 .17 pg Fe/cell ,P ＞0 .05).大鼠肩袖损伤模型中,MR/PA成像能有效示踪标记TSCs分别长达21 d和7 d .结论 PLGA/IO MPs能有效标记TSCs长达21 d ,双模态MR/PA成像在大鼠肩袖损伤模型中能有效示踪标记TSCs .
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人脂肪来源干细胞增强型绿色荧光蛋白质粒转染及体内示踪
目的:对于人脂肪来源干细胞的应用,目前已开始进行临床前期体内移植实验,细胞标记与示踪是证明移植细胞转归和生成组织来源的关键问题.实验观察了带有增强型绿色荧光蛋白的基因质粒转染人脂肪来源干细胞的效果及体内示踪效应.方法:实验于2007-03/12在沈阳军区总医院整形美容外科中心实验室(省级)、沈阳军区呼吸中心实验室(国家级)和全军神经外科中心实验室(国家级)完成.①细胞来源与动物:脂肪组织取自1例腹壁整形术女性患者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级雄性裸鼠8只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.大肠杆菌JM109由本室保存.转染质粒pEGFP-N3为美国Clontech公司产品.②实验方法:无菌条件下切取患者脂肪组织,采用酶消化法体外分离培养脂肪来源干细胞,传至第3代时以2.5×107L-1密度接种,分别加入200,300,400,500,600,700,800,900mg/L G418,确定G418杀死所有细胞的低浓度(C0).采用脂质体法对人脂肪来源干细胞进行pEGFP-N3质粒转染,C0浓度G418筛选,计数阳性细胞率.培养5代后制备单个细胞悬液,浓度为8×1010L-1,植入到裸鼠背部皮下,采用活体化学发光和荧光成像系统观察大鼠荧光表达情况.结果:①体外培养的人脂肪来源干细胞贴壁后为成纤维细胞样,细胞生长活性良好,传代后生长速度加快.②当G418浓度为600 mg/L时细胞全部死亡,故将此浓度设定为C0.③pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞率为(13.0±3.5)%,经C0浓度G418筛选后高达(65.0±5.4)%.④裸鼠背部皮下注射脂肪来源干细胞8周后,可见移植区周围弥漫分布绿色荧光区,提示植入细胞存活并广泛分布.结论:增强型绿色荧光蛋白质粒可以有效转染人脂肪来源干细胞,并在裸鼠体内呈现良好的示踪效果.
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大鼠毛囊干细胞的体外分离培养及增强型绿色荧光蛋白示踪
目的:毛囊干细胞具有分化为表皮、皮脂腺和毛囊的能力,在烧伤、创伤及大面积皮肤缺损的细胞治疗和基因治疗等方面均有很好的应用前景,但其特异性标志物和体外培养条件等方面存在争议.实验拟进一步探讨毛囊干细胞体外分离培养的方法,以及增强型绿色荧光蛋白作为其示踪标志物的可行性.方法:实验于2007-05/09在解放军第三军医大学细胞生物教研室完成.①材料:新生7 d龄SPF级SD大鼠5只,由解放军第三军医大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.pEGFP-N1质粒由本实验室保存.②实验方法:大鼠在体视显微镜下分离出含真皮鞘的完整毛囊,dispase消化,将毛囊从真皮鞘中挤出,收集形态完好且处于生长期的毛囊,分别在毛球部上端、皮脂腺下端横切毛囊,取中间部分置于胰酶和EDTA中联合消化,向所得细胞悬液中添加含10%胎牛血清DMEM/F12完全FAD培养基,常规培养7 d后,采用IV型胶原快速贴壁法两次筛选以分离纯化大鼠毛囊干细胞.待筛选后的细胞生长至70%～80%融合后,进行pEGFP-N1质粒细胞转染.③实验评估:通过超微结构观察与流式细胞仪检测CD34、α6-integrin的表达,对分离纯化的大鼠毛囊干细胞进行鉴定.转染24～72 h后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以毛囊干细胞克隆形成率判定标记细胞的增殖能力.结果:①细胞形态及超微结构:筛选后的毛囊干细胞形态均一,呈铺路石状,透射电镜显示细胞胞体小,核浆比例大,核仁明显,细胞器发育不成熟,处于原始状态.②细胞表型:高表达CD34和α6-integrin,细胞阳性率≥ 90%.③pEGFP-N1质粒转染及示踪:转染16 h左右细胞出现微弱绿色荧光,经G418筛选后稳定表达绿色荧光蛋白.④细胞克隆形成率:与转染前比较,转染后细胞克隆形成率明显降低(t =4.541,P < 0.01).结论:①利用二步酶消化法联合IV型胶原快速贴壁法可以获得较高纯度的毛囊干细胞.②增强型绿色荧光蛋白能稳定标记毛囊干细胞,是较理想的示踪方法,但细胞增殖能力受一定影响.
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荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞体内示踪方法
背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟.目的:观察不同浓度荧光活性染料CFSE标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪方法.方法:取C57BL/6J及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度CFSE染色后制备1:1混合细胞悬液;锥虫蓝染色鉴定细胞活性:将染色的混合细胞输注BALB/c小鼠后不同时间点,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例.结果与结论:CFSE标记的小鼠脾细胞活力良好,荧光显微镜下见全部细胞标记后均发绿色荧光,形态正常,CFSE标记阳性率为95%.CFSE染色时,在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰,即CFSE低浓度用0.3 μmol/L,高浓度用6 μmol/L.异基因的C57BL/6J脾细胞在输注1 d后就快速消失,而同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在,但是两种细胞荧光强度均未见降低,说明荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞进行体内示踪是一种稳定的示踪方法.
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BrdU标记大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨能力的变化
背景:BrdU标记是一种标记率高、标记简便的标记物,但其毒性报道不一.目的:观察BrdU标记对SD大鼠骨髓间充质千细胞增殖与成骨能力的影响.方法:直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,0.2%Brdu标记后检测其增殖能力、克隆形成能力;经成骨诱导液诱导培养3周后,利用茜素红染色,荧光免疫组织化学和RT-PCR观测标记前后骨髓间充质干细胞成骨能力的变化情况.结果与结论:Brdu标记后骨髓间充质干细胞克隆形成能力明显减弱,在克隆个数和面积上均小于正常对照组(P<0.05);在增殖能力方面,BrdU标记后第4天开始进入对数增长期时增殖较慢,高峰较低(P<0.05);在成骨能力方面,经成骨诱导后BrdU标记组与正常对照组的骨髓间充质千细胞均表达骨钙素、Ⅰ型胶原,并且都有明显的钙结节形成,RT-PCR检测显示标记前后骨髓间充质干细胞在骨钙索基因的表达方面差异无显著性意义(P>0.05).提示BrdU标记抑制骨髓间充质干细胞的克隆增殖形成能力,但不会降低其成骨分化能力,可以广泛应用于骨髓间充质干细胞作为种子细胞干细胞研究的示踪剂.
关键词： 细胞示踪 Brdu 骨髓间充质干细胞 组织工程 Real time-PCR -
新型免疫状态定量监测皮肤移植模型小鼠的特异性
背景:器官移植后如何监测受者的免疫状态,并预测排斥反应的发生,从而调整免疫抑制剂的用量是当前面临的重要问题.目的:探索新型免疫状态定量监测方法在小鼠皮肤移植模型中是否有抗原特异性.方法:建立 C57→BALB/c皮肤移植排斥模型,分别输注 C57/BALB/c 混合脾细胞悬液及第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞,在细胞输注后检测2种混合细胞悬液比例变化及供体细胞杀伤率,同时设置 BALB/c→BALB/c 同系皮肤移植对照组,免疫低下裸鼠对照组及免疫抑制剂对照组与之对比.结果与结论:C57/BALB/c悬液-移植排斥模型组和C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组小鼠对供体 C57 脾细胞有强烈的特异性杀伤作用,其中C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组特异性杀伤作用稍弱,而输注第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞的小鼠细胞注射2~4 h内没有明显特异杀伤作用,但免疫低下的裸鼠始终未表现出特异性杀伤.说明实验建立的抗原特异性免疫状态检测方法能够快速地检测出皮肤移植受体的免疫状态.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记
背景：目前，对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。
目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。
方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠，无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓，用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞，通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化，在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。
结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞，经流式细胞仪分析，培养出的细胞CD34阳性率为17.5%，CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%，与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法，两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞， CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 -
间充质干细胞归巢到大鼠肺气肿组织分化为肺血管内皮细胞
背景:间充质干细胞具有独特的归巢、免疫调节及抗炎作用,经静脉注射移植后能归巢到损害的靶器官及组织发挥其功能,修复受损组织.目的:观察间充质干细胞移植后,肺气肿大鼠的肺组织病理改变.方法:将24只雌性Wistar大鼠随机分为实验组、对照组、健康对照组,前两组应用烟熏加气管内滴入猪胰弹生蛋白酶的方法制作肺气肿模型,造模成功后,实验组尾静脉注射BrdU标记骨髓间充质干细胞,对照组注射PBS.14d后,检测观察大鼠肺组织病理学变化,检测肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α水平,肺泡壁细胞凋亡指数、抗CD34及抗BrdU免疫组织化学变化.结果与结论:①与健康对照组比较,对照组肿瘤坏死因子α水平、肺泡壁细胞凋亡指数升高(P＜0.01),抗Brdu及抗CD34相对面积减少(P＜0.01);与对照组比较,实验组肿瘤坏死因子α水平、肺泡壁细胞凋亡指数降低(P＜0.01),抗Brdu及抗CD34相对面积增加(P＜0.01);②肺组织病理学检查显示,对照组及实验组均呈现肺气肿样改变,但实验组轻于对照组;③结果表明,间充质干细胞能抑制实验性肺气肿的炎症反应及细胞凋亡,改善肺气肿病理学变化且骨髓间充质干细胞可分化为肺血管内皮细胞.
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以EdU体外标记人脐带间充质干细胞：5，10μmol/L是其适浓度
背景：EdU为新一代细胞核标记物，目前对此标记的研究较少。
目的：采取EdU标记人脐带间充质干细胞，筛选出EdU标记人脐带间充质干细胞的适浓度。
方法：采用组织块法分离、纯化及传代培养人脐带间充质干细胞，倒置显微镜观察其形态及生长情况，流式细胞仪鉴定细胞表面标志物，并进行成脂诱导分化能力鉴定。分别采用5，10，20，50，100μmol/L浓度的EdU标记脐带间充质干细胞24 h，选择标记率高的优化浓度，绘制细胞增殖曲线。
结果与结论：倒置显微镜下观察细胞为贴壁生长，形态为长梭形，且EdU标记后的细胞形态与其一致，流式细胞仪检测CD44呈阳性表达，成脂诱导后具有向脂肪细胞分化的能力。5，10μmol/L EdU的标记率高，两种浓度标记的人脐带间充质干细胞生长曲线未见明显差异，故5，10μmol/L是体外标记人脐带间充质干细胞的适浓度。 -
磁性氧化铁纳米粒子造影剂在MRI应用进展
近年来,磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)已有广泛的体内应用:如磁共振成像,细胞标记、干细胞祖细胞示踪及组织修复,肿瘤生物探针检测,移植排斥反应的监测等方面,本文综述了USPIO的化学合成、表面修饰以及它们的生物医学应用进展.
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小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法
目的研究小鼠自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)体外诱导增殖及其过继免疫后示踪的方法.方法建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型,体外诱导、增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC,进行电镜观察,并在体外以Brdu、DAPI标记,混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内,观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况.结果DC、NK细胞在细胞因子诱导下体外成倍扩增,电镜下可见典型的DC、NK细胞.Brdu对细胞的标记率约65%,DAPI对细胞的标记率可达100%.在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC、NK细胞的分布.结论Brdu、DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法.
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MRI示踪超顺磁性氧化铁标记兔脂肪干细胞治疗关节软骨缺损的研究
目的：利用磁共振成像技术动态监测超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide ，SPIO ）标记的兔脂肪干细胞（adipose‐derived stemcells ，ADSCs）在兔体内的变化及其对兔膝关节软骨缺损修复的进程。方法：用不同浓度（0、12．5、25、50、100μg／mL）的超顺SPIO标记ADSCs。采用普鲁士蓝染色法测定细胞的标记情况，并计算细胞标记率。用细胞计数试剂盒（CCK‐8）测定不同浓度的SPIO对细胞活性的影响。将不同浓度SPIO标记的不同数量的 ADSCs快速均匀地重悬于盛有1％琼脂糖的冷冻管中进行体外M RI成像，测量T2*图像信号强度。将50μg／mL的SPIO标记的ADSCs接种至聚乳酸‐羟基乙酸共聚酶[Poly （lactic‐co‐glycolic acid），PLGA]支架材料后，回植入兔（n＝5）膝关节软骨直径为3 mm的软骨缺损处，分别于术后1、4、8和12周进行M RI T 2*序列动态扫描，监测干细胞在体内的变化及关节软骨的修复情况。结果：原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观，培养7 d后细胞呈聚集样生长。普鲁士蓝染色见细胞质内有明显的蓝色致密颗粒，随着SPIO浓度的升高，蓝色致密颗粒增多；当SPIO的浓度≥50μg／mL时，细胞的标记率可达100％。CCK‐8检测显示，SPIO的浓度越高，细胞的活性越低，当SPIO的浓度大于50μg／mL时，细胞的活性明显降低（P＜0．05）。体内MRI显示，术后1周和4周可见颗粒状低信号区域，信号强度明显低于对照组。术后8周，颗粒状低信号范围逐渐缩小，信号强度接近周围组织，说明S PIO标记的ADSCs在动物体内存活良好，并正常分裂增殖，形成正常关节软骨结构。结论：M RI联合SPIO可以动态监测细胞在体内的分布、生长和转归，有望作为一种动态监测组织工程修复关节软骨缺损效果的方法。
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Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的初步研究
目的 构建Bcl-2基因修饰慢病毒质粒,建立稳定表达Bcl-2基因的骨髓间充质干细胞系,探讨Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗ALF的可行性.方法 PCR合成Bcl-2基因片段并插入GV287空载体后扩增进行慢病毒包装,使用Bcl-2慢病毒液转染大鼠骨髓间充质干细胞,使用单纯未处理骨髓间充质干细胞,移植急性肝损伤模型大鼠,观察移植后大鼠存活情况及其肝脏病理改变.结果 得到纯化的骨髓间充质干细胞细胞株;成功分离Bcl-2基因DNA片段并构建Bcl-2基因重组慢病毒质粒,并成功转染到骨髓间充质干细胞中,经荧光显微镜检测GFP荧光及免疫印迹蛋白检测,转染后细胞可高表达Bcl-2基因,转染后细胞状态较好,可进行移植实验;模型鼠经过尾静脉移植骨髓间充质干细胞后,共聚焦显微镜下观察肝脏冰冻切片病理,骨髓间充质干细胞,可以定植到损伤肝脏组织.结论 初步证实,骨髓间充质干细胞能够在急性肝损伤大鼠肝脏归巢,并且能发挥一定程度治疗作用.
