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毛囊干细胞—组织工程化皮肤理想的种子细胞
皮肤在抵御微生物入侵、紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温方面起重要作用,同时也是免疫系统的组成部分之一.皮肤损伤,特别是皮肤大面积缺损是临床上较为棘手的问题,因此构建组织工程化皮肤已经成为当今研究的热点.近年来,以皮肤干细胞为种子细胞构建人工皮肤替代物成为研究组织工程化皮肤的新方法.皮肤干细胞分为表皮干细胞和毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFC),HFC在实现毛发再生、皮脂腺更替以及促进皮肤损伤的修复方面有重大意义.
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毛发移植进展
目的:综述毛发移植的研究进展.方法:采用文献回顾和综合分析方法.结果:毛发移植有许多新的术式、新设备出现,毛发移植的基础研究已达到分子和基因水平,然而毛囊干细胞的研究和毛囊体外培养的临床应用还很不成熟.结论:毛发组织工程学的重大突破将提供更好的毛发移植技术,对整形科技极具现实意义.
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多能性干细胞与再生医学
在体内胚胎发育是一个连续的、时空精密调控的过程,伴随着受精卵的分裂、分化,终发育为一个包含多种细胞类型,并由多种细胞类型形成复杂组织结构的完整个体.将原本连续的胚胎发育过程中的特殊阶段维持下来,使其既能维持在自我更新水平,又能回归发育过程分化为其他类型的细胞,这种细胞称之为干细胞.有些类型的干细胞是发育中不存在的,人为的调控信号通路将其在体外维持下来,例如通过持续激活LIF-Stat3 通路和经BMP4 通路从早期囊胚内细胞团建立的胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES 细胞),通过调控成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF),activin通路从植入后胚胎的表胚层建立的表胚层干细胞[1];有些类型的干细胞在发育中存在,并作为"干细胞库"更新、修复组织,例如造血干细胞、毛囊干细胞等.
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毛囊生物学特性的某些研究进展
毛囊是一种结构复杂的皮肤附属器官,具有自我更新和周期性生长的特点.本文将有关毛乳头细胞(dermal papilla cell,DPC)在毛囊生长过程中的重要作用及毛囊干细胞等研究综述如下.
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中药益发复方含药血清对毛囊干细胞增殖及K19、β1整合素mRNA表达的调控作用
目的 本研究主要观察中药益发复方含药血清对大鼠毛囊千细胞增殖及K19、β1整合素mRNA表达水平的调控作用.方法 自制益发复方含药血清;取7～8日龄Wistar大鼠,分离隆突区毛囊,用二步消化酶法获取毛囊外根鞘细胞,再用Ⅳ型胶原黏附法分离毛囊干细胞.将分离得到的毛囊干细胞分为实验组a1-a3(培养液中分别加入10％高、中、低剂量的益发含药血清)、对照组b(培养液中加入10％空白对照血清)及对照组c只加无血清角质细胞培养液(KSFM).用MTT法制作生长曲线,观察各组培养细胞生长规律和特性;运用K19、β1整合素单克隆抗体免疫组化鉴定培养细胞;RT-PCR检测各组培养细胞K19、β1整合素mRNA表达水平.结果 免疫组化鉴定结果显示Ⅳ型胶原黏附细胞符合毛囊干细胞特征.实验组毛囊千细胞克隆形成较早、较多,MTT法检测显示益发血清组毛囊干细胞增生速度明显优于对照组;实验组毛囊干细胞K19、β1整合素基因表达水平较对照组显著提高(P＜0.05),中剂量的益发含药血清(1.65 g/mL)作用为明显.结论中药益发复方能促进毛囊干细胞增生及特异性标记物K19、β1整合素基因表达,这可能是其治疗脱发病及促进毛发生长的药理机制之一.
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毛囊干细胞及Noggin对其调控作用的研究进展
毛囊干细胞(HFSC)通常能够分化为角质细胞、皮脂腺细胞和短暂扩充祖细胞,因其快速增殖的能力,HFSC为细胞的治疗提供了构建干细胞来源的基础.本综述将系统描述HFSC的定位、培养以及分子标志物,为鉴定、分离细胞提供有力的参考.同时针对HFSC增殖和分化调控的关键基因Noggin,从基因发现、分子功能等进行全面阐述,并结合BMP信号通路叙述Noggin调控HFSC研究的新进展.
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诱导多能干细胞治疗脱发研究新进展
脱发性疾病是临床上常见的一组影响美容、心理和健康的疾病.目前,脱发性疾病的发病机制仍不甚清楚.毛囊结构、毛乳头细胞及毛囊干细胞异常可能与脱发性疾病密切相关.诱导多能干细胞(iPSC)是将外源性转录因子导入已分化的体细胞中并重新编排形成的具有类似于胚胎干细胞全能性的多潜能细胞,在临床医学和再生医学方面具有广阔的应用前景.iPSC可分化为毛乳头细胞、毛囊干细胞及再生毛囊,为治疗脱发性疾病开辟了新道路.
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毛囊干细胞定位和体外向表皮分化
目的研究毛囊干细胞在毛发不同生长周期中定位和体外向表皮分化能力.方法采用免疫荧光染色检测皮肤组织中K19表达;分离毛囊干细胞并体外培养,以成纤维细胞为底物,采用气-液界面立体培养,形态学观察毛囊干细胞体外向表皮分化能力.结果K19阳性细胞主要定位于毛囊外根鞘.生长期毛发中,K19阳性细胞主要位于毛囊外根鞘膨突处和下部毛球部;退行期和静止期毛发中K19阳性细胞则沿毛囊外根鞘处连续分布,并在新的生长周期开始再次分开为两处.体外采用真皮类似物立体培养外根鞘细胞,获得具有多层表皮结构的皮肤类似物.结论毛囊干细胞主要定位于毛囊外根鞘,并随毛囊周期性生长有所迁移,体外具有形成表皮结构的能力.
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毛囊干细胞在组织再生及皮肤组织工程中的研究进展
毛囊干细胞属于毛囊表皮干细胞系，与表皮干细胞同属上皮来源的成体干细胞。由于其具有来源广泛、取材容易、不涉及伦理及道德问题等优势而逐渐成为干细胞治疗领域的新宠。现就其在组织再生及皮肤组织工程中的研究进展综述如下。一、毛囊干细胞的特性毛囊干细胞主要存在于毛囊隆突区及毛囊的下1/3[1]。
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毛囊干细胞的研究进展
毛囊干细胞是毛囊组织维持自我更新的基础,它具有干细胞的一般特征,普遍认为定位于毛囊隆突部.毛囊干细胞的标记物是分离和鉴定细胞的重要依据,在多种信号通路调控下可以分化为毛囊、皮脂腺和表皮.至此,毛囊干细胞在组织工程皮肤中的作用引起人们的关注,就毛囊干细胞的研究进展作一阐述.
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毛囊干细胞的分离及培养方法研究
目的 建立一种分离效率高、创伤小的毛囊干细胞分离方法,筛选毛囊干细胞体外培养的优条件,考察毛囊干细胞的体外增殖活性.方法 获取兔胡须部皮肤全层,比较2种不同分离方法获得细胞的贴壁、增殖及克隆形成情况.通过免疫组化的方法检测毛囊干细胞β1整合素、CK19表达情况.选用MTT法和乳酸脱氢酶来间接反映毛囊干细胞的增殖能力.分析细胞周期考察细胞增殖过程中各期细胞的分布.观察血清浓度梯度条件培养液对毛囊干细胞增殖的影响.结果 "两步酶"法的分离能获得大量细胞且细胞迅速贴壁,克隆迅速形成.获取的毛囊干细胞胞浆中有β1整合素、CK19的阳性表达.毛囊干细胞生长曲线及细胞周期都表明毛囊干细胞有高增殖能力.毛囊干细胞增殖表现出血清浓度的依赖.结论 "两步酶"法是一种分离效率高、创伤小的方法,能够获取大量高表达β1整合素、CK19的毛囊干细胞.毛囊干细胞在适当条件下表现为高增殖能力,其生长有一定的血清依赖性.
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微环境调控毛囊干细胞增殖与分化的研究进展
毛囊干细胞生存的微环境改变使毛囊干细胞的增殖、分化也发生改变.微环境对于细胞的调控是通过信号转导通路及一些重要的信号分子实现的,如整合素家族、Wnt和Notch信号转导通路及c-myc基因和β-连环蛋白等.
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氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中Wnt信号通路介导基因的调控
背景:研究发现氯化锂有促进毛囊干细胞向毛囊上皮定向分化的作用,但其分子调节机制仍不清楚.目的:通过外源性因子氯化锂干预人毛囊干细胞,观察Wnt信号通路中主要下游分子及目的基因的改变,探讨氯化锂对毛囊干细胞定向分化的诱导作用.方法:取正常成人除皱术后的头皮,采用两步酶消化法结合手术显微镜分选毛囊干细胞,采用角蛋白10抗体-异硫氰酸荧光素鉴定毛囊干细胞.以外源性因子氯化锂干预人毛囊干细胞.结果与结论:氯化锂干预5 d后可发现毛囊干细胞体积变大,核浆比减小,Wnt信号通路中β-catenin、cyclinD1表达增强,GSK3β、Tcf3表达减弱,c-myc在氯化锂浓度低时增强浓度高时减弱.提示氯化锂可影响毛囊干细胞中Wnt信号通路β-catenin、GSK3β、Tcf3、c-myc和cyclinD1的表达水平,可能对毛囊干细胞的分化起到重要作用.
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大鼠毛囊干细胞的体外分离培养及增强型绿色荧光蛋白示踪
目的:毛囊干细胞具有分化为表皮、皮脂腺和毛囊的能力,在烧伤、创伤及大面积皮肤缺损的细胞治疗和基因治疗等方面均有很好的应用前景,但其特异性标志物和体外培养条件等方面存在争议.实验拟进一步探讨毛囊干细胞体外分离培养的方法,以及增强型绿色荧光蛋白作为其示踪标志物的可行性.方法:实验于2007-05/09在解放军第三军医大学细胞生物教研室完成.①材料:新生7 d龄SPF级SD大鼠5只,由解放军第三军医大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.pEGFP-N1质粒由本实验室保存.②实验方法:大鼠在体视显微镜下分离出含真皮鞘的完整毛囊,dispase消化,将毛囊从真皮鞘中挤出,收集形态完好且处于生长期的毛囊,分别在毛球部上端、皮脂腺下端横切毛囊,取中间部分置于胰酶和EDTA中联合消化,向所得细胞悬液中添加含10%胎牛血清DMEM/F12完全FAD培养基,常规培养7 d后,采用IV型胶原快速贴壁法两次筛选以分离纯化大鼠毛囊干细胞.待筛选后的细胞生长至70%～80%融合后,进行pEGFP-N1质粒细胞转染.③实验评估:通过超微结构观察与流式细胞仪检测CD34、α6-integrin的表达,对分离纯化的大鼠毛囊干细胞进行鉴定.转染24～72 h后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以毛囊干细胞克隆形成率判定标记细胞的增殖能力.结果:①细胞形态及超微结构:筛选后的毛囊干细胞形态均一,呈铺路石状,透射电镜显示细胞胞体小,核浆比例大,核仁明显,细胞器发育不成熟,处于原始状态.②细胞表型:高表达CD34和α6-integrin,细胞阳性率≥ 90%.③pEGFP-N1质粒转染及示踪:转染16 h左右细胞出现微弱绿色荧光,经G418筛选后稳定表达绿色荧光蛋白.④细胞克隆形成率:与转染前比较,转染后细胞克隆形成率明显降低(t =4.541,P < 0.01).结论:①利用二步酶消化法联合IV型胶原快速贴壁法可以获得较高纯度的毛囊干细胞.②增强型绿色荧光蛋白能稳定标记毛囊干细胞,是较理想的示踪方法,但细胞增殖能力受一定影响.
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表皮干细胞与毛囊干细胞生物学特性的比较
背景:获取更合适的组织工程皮肤种子细胞可使皮肤功能得到更好的修复.目的:分离、培养表皮干细胞和毛囊干细胞,并比较两种细胞的生物学特性.方法:体外分离培养2月龄新西兰兔表皮干细胞和毛囊干细胞,取生长良好的第2,3,6代细胞观察其生物学特性.结果与结论:毛囊干细胞较表皮干细胞贴壁快,具有更高的增殖活性.免疫组化及荧光定量PCR检测显示毛囊干细胞β1整合素、角蛋白19蛋白及mRNA表达均明显高于表皮干细胞.提示作为皮肤组织工程的种子细胞,毛囊干细胞较表皮干细胞更具优势.
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毛囊干细胞在皮肤伤口修复中的促进作用
背景：毛囊干细胞来源于皮肤、毛发，数量极其可观，取材后无严重的并发症和免疫原性，可供自体移植，是容易获取的干细胞来源之一。目的：综述毛囊干细胞促进皮肤伤口修复的作用因素，以期为该领域研究提供有效的实验依据。方法：应用计算机以“毛囊干细胞、皮肤修复、再生医学、组织工程”或“hair fol icle stem cel ，skin repairing， regenerative medicine，tissue engineering”为检索词检索CNKI 和 PubMed 数据库1999年1月至2014年12月发表的关于毛囊干细胞促进皮肤伤口修复的文章，终选择45篇文章进行综述。结果与结论：毛囊干细胞作为一种容易获得、数量可观、使用较为安全以及具有分化潜能的成体干细胞，可以通过皮肤早期血管化、表皮及附属器官的再生、信号通路作用及转录因子调节等方面的影响，促进皮肤伤口的修复，能为再生医学及组织工程研究提供良好的种子细胞。
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损伤皮肤修复和伤口愈合过程中的干细胞：问题与前景
背景：当前皮肤慢性伤口的治疗方法是有限的，成体干细胞具有治疗许多皮肤疾病潜在功能。
目的：综述干细胞在损伤皮肤修复和伤口愈合方面的作用。
方法：第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI：2000至2010年)和Medline数据库(2000至2010年)，检索词分别为“表皮干细胞；毛囊干细胞；干细胞；移植；表皮干细胞；真皮干细胞；”和“Epidermal stem cels；hair folicle stem cells；stem cels；Transplantation； Epidermal stem cels；Dermal stem cels”，共计489篇论文，语言分别设定为中文和英文。终纳入30篇文献。
结果与结论：表皮干细胞和其他成体干细胞作为细胞治疗应用于治愈伤口和其他皮肤疾病。表皮干细胞是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉，机体内表皮干细胞多处于静息状态，只有当皮肤受损或在体外培养的情况下，该细胞分裂、增殖才明显加快。表皮干细胞主要通过不对称分裂来维持表皮的稳定，具体表现为1个亚细胞群的不对称分裂，其每次分裂产生的2个子细胞，其中1个具有干细胞自身的特性，而另1个子细胞分化为短暂扩充细胞，后者经过3-5次分裂后形成有丝分裂后细胞，其不断变迁为基底层上的终末分化细胞，后以皮屑的形式从表皮脱落。此外，在创伤修复的过程中甚至在生理条件下，是否由于表皮因素的影响而发生细胞凋亡、迁移和分化，目前仍未知。因此，干细胞在损伤皮肤修复和伤口愈合方面的作用仍有很多问题尚待解决。 -
角质细胞无血清培养基促进大鼠毛囊干细胞的增殖
背景：以往研究培养毛囊干细胞多使用DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清培养基，而进年来开发出的角质细胞无血清培养基也可应用于毛囊干细胞的培养。
目的：观察3种不同培养基对大鼠毛囊干细胞增殖情况及干细胞纯度的影响。
方法：取大鼠触须部皮肤组织，体式显微镜下分离出毛囊组织，中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液“两步酶法”消化。所得细胞悬液按细胞数平均分为3份，分别使用角质细胞无血清培养基、DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清及角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清共3种培养基培养，Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞，进行传代培养。
结果与结论：培养毛囊干细胞传至第3代，锥虫蓝染色计数法检测结果显示，此3组间细胞活率差异无显著性意义(P>0.05)。CCK8比色法检测细胞生长曲线显示，培养前2 d，此3组细胞生长均较缓慢；培养4 d，细胞生长进入对数生长期，3种培养基培养的细胞增殖活性：角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组>DMEM/F12+10%胎牛血清>角质细胞无血清培养基(P<0.05)。流式细胞仪检测显示，角质细胞无血清培养基组CD34的表达高于角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组(P<0.05)。DMEM/F12+10%胎牛血清组中CD34、β1-整合素(CD29)及CK15标记物的表达低于其他2组(P<0.05)。结果表明，角质细胞无血清培养基较DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清能培养出纯度更高的毛囊干细胞，并且在此培养基培养的基础上加入血清，能够促进毛囊干细胞的增殖。 -
小鼠毛囊再生与胸腺素β4的促进效应
背景：近年来研究表明，胸腺素β4与毛囊的生长发育和毛发的生长周期有着密切关系，但其作用机制尚不清楚。
目的：探讨胸腺素β4通过Wnt信号通路作用于毛囊干细胞对毛囊再生的促进作用。
方法：将实验小鼠随机分为低剂量胸腺素β4组、高剂量胸腺素β4组和对照组，使用松香/石蜡混合制剂建立脱毛模型。低剂量胸腺素β4组和高剂量胸腺素β4组给药浓度分别为0.3μg/50μL和3μg/50μL，对照组给予等量PBS，每隔12 h给药1次，均匀涂抹于小鼠脱毛背部。应用大体照相、苏木精-伊红染色、免疫组化及原位杂交技术，观察毛发生长情况，检测不同时间点和不同给药浓度下小鼠毛囊根部细胞β-catenin、LEF-1 mRNA的表达水平。
结果与结论：低剂量胸腺素β4组毛发再生速度高于高剂量胸腺素β4组和对照组。苏木精-伊红染色显示在脱毛初期，各组小鼠真皮和皮下脂肪层有一定炎性细胞浸润，9d时，低剂量胸腺素β4组生长期毛囊数量明显多于高剂量胸腺素β4组和对照组。免疫组织化学和原位杂交结果分别显示β-catenin和LEF-1 mRNA主要表达于毛囊隆突部和外根鞘处细胞的胞浆中，经积分吸光度分析发现低剂量胸腺素β4组阳性细胞数量和染色强度高于高剂量胸腺素β4组和对照组(P <0.05)，高剂量胸腺素β4组与对照组间差异无显著性意义。结果显示低剂量的胸腺素β4可以增加部分毛囊外根鞘处细胞内β-catenin和LEF-1 mRNA的表达。胸腺素β4可以促进毛囊再生的机制可能与影响Wnt信号通路有关。 -
兔膀胱脱细胞基质负载大鼠毛囊干细胞的体外培养
背景：组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的修复和重建开辟了新的途径，膀胱脱细胞基质是较好的泌尿系组织工程修复的替代材料。
目的：构建毛囊干细胞与异种膀胱脱细胞基质为支架的细胞支架复合物，体外培养观察细胞在支架上的生长状态。
方法：制备新西兰兔膀胱脱细胞基质，通过扫描电镜和 Masson 染色检测材料脱细胞效果，采用二次沉淀法将第3代毛囊干细胞静态接种于膀胱脱细胞基质表面，倒置显微镜下观察细胞生长状态，并绘制细胞生长曲线，组织学检测和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况。
结果与结论：制备的膀胱脱细胞基质为白色半透明膜状，扫描电镜下观察为纤维网状结构，未见细胞残留。Masson染色提示膀胱脱细胞基质为胶原结构，无明显细胞残留。细胞材料体外复合培养48 h后倒置显微镜下观察膀胱脱细胞基质周围毛囊干细胞生长状态良好，1周后扫描电镜下观察毛囊干细胞伸展、黏附于支架表面。结果可见毛囊干细胞与膀胱脱细胞基质体外培养具有良好的生物相容性。
