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用HaCaT细胞和正常人黑素细胞构建组织工程皮肤
目的 探索用人永生化表皮细胞(HacaT)和黑素细胞复合鼠尾胶原凝胶支架构建组织工程皮肤的可行性.方法 HaCaT细胞和黑素细胞与鼠尾胶原复合,经历液下和气液面共13 d的培养,苏木素-伊红(HE)染色观察不同培养阶段组织学形态变化,S-100免疫组化染色观察黑素细胞分布情况.结果 随培养时间的延长,组织工程皮肤的细胞层数逐渐增加,结束时可达12～15层;同时,细胞层内发生黑素化,颜色逐渐加深,组织学结构可见黑素颗粒分布广泛,S-100免疫组化染色显示黑素细胞均匀分布于基底层.结论 在鼠尾胶原凝胶支架表面用HaCaT细胞和黑素细胞可构建出组织工程皮肤,为探索基于组织工程皮肤的化合物光毒性检测奠定基础.
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体外构建新型化妆品检测用皮肤Inspectskin Ⅰ的初步研究
目的 探讨ES源表皮干细胞(ESC)与高分子材料构建人工皮肤Inspectskin Ⅰ的方法,为化妆品皮肤毒性检验替代模型奠定基础.方法 采用嵌入式培养法,先将3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物(PHBV)支架与原代小鼠成纤维细胞共培养5 d构建真皮,再于表面放置ESC细胞,气-液界面培养7～10 d,形态学和β1整合素、CK10、CK19免疫组化观察.结果成纤维细胞可在真皮支架内粘附,ESC细胞可在支架表面增殖分化形成含基底层、棘层和角化层的复层表皮结构,免疫组化表明基底层以上细胞中表达CK10明显增多,基底层有些细胞仍呈β1整合素和CK19阳性.结论 Inspectskin Ⅰ替代皮肤模型是由ESC细胞分化形成的角化复层表皮结构和PHBV真皮结构共同构成的全层皮肤模型.
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重组人皮肤模型评价化妆品皮肤腐蚀性/刺激性替代方法的建立
目的 通过构建重组人EpiDerm皮肤模型,建立检测化妆品的皮肤腐蚀性/刺激性的替代试验方法;方法取人的包皮组织,分离表皮和真皮后分别进行原代培养,用鼠尾胶原构建皮肤模型,经气液面培养后,腐蚀性试验作用3min和1h,刺激性试验作用15min后续培养42h,检测化学物致皮肤模型细胞活性的改变四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT试验)和白介素-1α(IL-1α)的释放量(ELISA法),评价化学物的腐蚀性,刺激性.结果 腐蚀性试验中,MTT检测作用于3种腐蚀性化学物(正辛酸、10%KOH、丙烯酸)后,细胞相对活性均<50%(3min)和<15%(1h);而2种非腐蚀性化学物(四氯乙烯、丁香酚)使细胞相对活性变化不大.刺激性试验中,MTT检测4种刺激性化学物细胞相对活性,其中3种化学物(三氯乙烷、5%KOH、10%SLS)致细胞活性明显小于50%,2种非刺激性化学物(乙醇、丙二醇)和1%TritonX-100作用后细胞活性>50%,在ELISA实验中,仅TritonX-100致IL-1α释放量大于60pg/ml,说明其同样具有刺激性.结论 所建重组人皮肤模型试验方法基本成功,可以作为检测化学物皮肤腐蚀性和刺激性的体外替代方法.
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组织工程皮肤的现状和展望
皮肤损伤及修复是临床工作者面临的重大难题.自体皮肤移植因供体不足而受限,而异体移植则面临免疫排斥反应.利用组织工程技术制作组织工程皮肤因而成为有效的解决途径.随着种子细胞和支架材料等的不断完善,组织工程皮肤的基础研究将更加丰富,临床应用的前景更加广阔.本文从组织工程皮肤的结构、分类、应用、产品等方面对该领域的国内外新研究现状进行综述,分析了组织工程皮肤目前存在的问题,并提出未来发展方向即再生出含有毛囊、汗腺等附属器官的完整有功能的人类皮肤,对今后组织工程皮肤的研究和应用具有一定的参考价值.
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组织工程皮肤预防腮腺切除术后并发症的荟萃分析
目的 采用荟萃分析的方法评价组织工程皮肤(TES)预防腮腺切除术后并发症的有效性和安全性.方法 系统检索相关中英文数据库,包括CENTRAL(the Cochrane Central Register of Controlled Trials)、PubMed、EMBASE、中国期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、中文科技期刊全文数据库(VIP)、万方数字化期刊全文数据库(Wanfang)等,筛选出符合要求的25个随机对照试验,评价方法学质量并提取数据,对味觉出汗综合征(GSS)等腮腺切除术后并发症进行荟萃分析.结果 荟萃分析结果显示,与术后直接缝合相比,应用TES可以使GSS客观发生率降低84％[ RR=0.16,95％CI(0.13 ～ 0.21),P＜0.01]、GSS主观发生率降低86％ [RR=0.14,95％C/(0.10 ～ 0.19),P＜0.01];可以有效降低涎漏的发生[RR=0.23,95％CI(0.10 ～ 0.53),P＜0.01],有效改善面部凹陷畸形[RR=0.42,95％CI(0.18～0.95),P=0.04];有降低暂时性面神经麻痹发生率和增加血清积液发生率的趋势,但差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 现有证据表明,使用TES可以有效预防腮腺切除术后GSS、面部凹陷畸形及涎漏的发生.
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表皮干细胞体外培养体系的初步研究
目的 探讨以成纤维细胞Ⅰ型胶原网格模型体外培养表皮干细胞的可行性.方法 酶消化法获取细胞悬液,Ⅳ型胶原快速贴壁法分选表皮干细胞,将体外培养的表皮干细胞和成纤维细胞接种于0.01%的戊二醛交联的Ⅰ型胶原上,气-液界面培养2周,免疫组化法、流式细胞仪和细胞周期来鉴定贴壁细胞,共聚焦显微镜和扫描电镜观察细胞材料.结果 贴壁细胞CK19和P63阳性表达,β1整合(CD29)表达率为98.57%,CD71表达率为9.05%,94.99%细胞处于静息期,以上均表明该细胞是表皮干细胞,并在Ⅰ型胶原上呈鱼鳞状排列.结论 表皮干细胞在Ⅰ型胶原上生长良好,可以生成全层组织工程皮肤.
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脱细胞真皮基质及其临床应用
脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)作为一种永久性真皮支架已成功用于皮肤创面修复、组织充填、重建及美容整形领域.由于ADM去除了皮肤组织中的细胞成分和部分可溶性蛋白,使其免疫原性显著降低,并且提高了组织相容性,被广泛应用于烧创伤所致的皮肤缺损以及口腔黏膜修复、腹壁缺损修补、硬脑膜修补、软硬组织充填及乳房重建等领域,此外,作为人工真皮的支架材料还被应用于组织工程皮肤的构建.
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不同年龄阶段人脱细胞真皮的制备及细胞渗透性研究
目的 制备不同年龄阶段的人脱细胞真皮(ADM),并进行体外细胞渗透性研究,为改良ADM支架提供新的思路.方法 利用氢氧化钠(NaOH)消蚀+冻融法制备ADM,对比青年人与老年人皮肤制备的ADM孔隙率和细胞毒性,在两种真皮的网状层接种人包皮成纤维细胞(FB),于接种后3、6、9d通过HE染色比较不同年龄阶段ADM的细胞渗透性.结果 成功获得ADM,两组ADM细胞毒性低,老年组ADM孔隙率较青年组更理想,老年组ADM更多见到细胞形成复层并长入基质内部.结论 NaOH消蚀+冻融法制备的ADM性状优良,其中老年人ADM的细胞渗透性较青年人更为理想,是一种良好的组织工程皮肤支架.
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改良法制备人脱细胞真皮的特性与体外细胞相容性
目的 探讨改良法制备人脱细胞真皮(ADM)特性及与体外细胞相容性.方法 按传统法及改良法分别将健康成人皮肤脱去细胞成分,并分析ADM的孔隙率、体外降解时间及改良法ADM浸润液对脂肪干细胞的细胞毒性;HE染色、扫描电子显微镜(SEM)检测其脱细胞效率、胶原完整性、孔隙大小及脂肪干细胞相容性.结果 两种方法均可完整脱去细胞成分,并较好保持胶原支架的完整性;改良法ADM 孔隙率93.1%±1.02%明显高于传统法ADM孔隙率74.27%±2.04%(P<0.05);改良法ADM浸润液无明显细胞毒性、两种ADM体外降解时间差异无统计学意义(P>0.05);两种ADM基底面孔隙直径差异无统计学意义(P>0.05),而改良法ADM网状面孔隙直径(102.38±15.63) μm明显大于传统法ADM(181.21±66.96) μm(P<0.05).结论 改良法处理ADM脱细胞效果良好,无明显细胞毒性,具有更高的孔隙率,更大的孔径,脂肪干细胞的细胞渗透性更强.
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不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的增殖分化能力比较
目的 比较三维条件下不同代次角质形成细胞构建的表皮形态及增殖分化情况.方法 采用不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤,通过苏木精-伊红(HE)和高碘酸-希夫(PAS)染色,观察各组组织工程皮肤的结构形态；并利用角蛋白CK1/CK10、CK5/CK14、细胞增殖核抗原Ki-67免疫组织化学染色,比较各组组织工程皮肤表皮的增殖分化能力.结果 不同代次角质形成细胞构建的组织工程皮肤都有明显的表皮真皮结构.1、2代较其他代次分层情况好,2代表皮层厚度明显高于其他代次(P＜0.05).加Ⅳ型胶原组的表皮真皮间黏附的紧密程度高于未加Ⅳ型胶原组,Ⅳ型胶原对表皮的厚度影响不大(P＞0.05).Ⅳ型胶原组PAS染色阴性,说明单独加Ⅳ型胶原不能形成基底膜结构.2代角质形成细胞Ki-67增殖系数接近正常皮肤,其余各代次角质形成细胞的增殖系数逐渐减少(P＜0.05).CK1/CK10、CK5/CK14在1、2代皮肤中阳性表达明显,其余代次对于两种角蛋白的表达并不明显.结论 3代以前角质形成细胞有更好的增殖分化能力,更适合作为组织工程皮肤的种子细胞.
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复方壳多糖组织工程皮肤的组织学特性
目的 评价制备的复方壳多糖组织工程皮肤在组织学方面的特性,为其修复皮肤缺损创面提供实验依据.方法 通过苏木精-伊红(HE)染色、高碘酸-希夫(PAS)染色、免疫组织化学染色及电镜,观察组织工程皮肤的组织学特征,包括表皮、真皮及两者的连接结构基底膜.结果 制备的复方壳多糖组织工程皮肤表皮细胞增殖活跃,分层分化良好,厚约150 μm,真皮层细胞生长正常,排列有序.PAS染色示真表皮间有均匀红染的条带出现,免疫组织化学染色结果显示Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原、层黏蛋白反应阳性,在电镜下可见角质形成细胞间大量桥粒,基底层内侧较多半桥粒,与机体皮肤结构相似.结论 复方壳多糖组织工程皮肤组织结构良好,符合新型皮肤替代物在治疗皮肤缺损时的组织学要求.
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组织工程皮肤及其临床应用
皮肤缺损多由急、慢性损伤引起.急性损伤主要为各种外伤所致,以及手术创面、烧(冻)伤和火器伤等;慢性损伤则常见于压伤(褥疮)、代谢性疾病(糖尿病足溃疡)、放(化)疗后皮肤慢性溃疡等.治疗时主要采用皮肤移植整复,但往往难以达到理想的整复效果.近年来,随着组织工程学技术的日臻完善,利用组织工程皮肤修复各种皮肤缺损正逐步应用于临床.组织工程皮肤是目前成功的组织工程产品,国外已经有各种相关产品投入临床使用,并取得了理想的治疗效果.
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酮洛芬及其异丙酯对HaCaT细胞构建的组织工程皮肤的渗透作用
目的体外构建适用于经皮给药研究的组织工程皮肤.方法以表皮角质形成细胞系HaCaT细胞及人真皮成纤维细胞为细胞来源,用I型牛胶原蛋白为真皮基质包埋成纤维细胞,其上接种HaCaT细胞,采用气-液界面方式培养,观察不同的培养介质对组织工程皮肤的影响,HE染色切片观察培养皮肤结构形态.以酮洛芬及其异丙酯为模型药物研究经皮渗透和代谢特性.结果 HaCaT细胞经气-液界面培养可形成类表皮层,但不能形成完整的角质层.维生素C可明显促进细胞增殖,维生素D3可促进细胞分化,雌二醇对此组织工程皮肤没有明显的影响.同皮肤细胞匀浆代谢相似,酮洛芬异丙酯被代谢成原药酮洛芬.结论 HaCaT细胞在气-液界面培养条件下可形成多层分化不完全的表皮层,保留了一定的酶活性,可用于药物的经皮渗透和代谢等研究.
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体外皮肤刺激模型的生物标志研究进展
皮肤刺激试验是人类健康相关产品危险性评价的常见项目,传统皮肤刺激试验采用实验动物进行,成本高周期长,给动物造成一定程度的痛苦.近年来,多种替代动物试验的体外模型被开发和应用.体外试验主要通过定量检测细胞活性和代谢变化的生物标志物预测体内的效应,应用广泛的生物标志物是细胞活性、炎性因子、胞质酶等,在生物技术的推动下,新的特异性标志物被开发和验证.
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组织工程皮肤的种子细胞--表皮干细胞的生物学行为研究进展
近年来,组织工程皮肤的研究已成为当前研究的热点之一.但直到现在还没有任何一种组织工程皮肤能作为理想的合适的皮肤覆盖物,以满足临床严重烧伤病人的需求,其中原因之一是未找到合适的种子细胞.通过对皮肤发育生物学研究发现,表皮干细胞在皮肤形成过程中起重要作用,皮肤的多层表皮结构通常是由表皮干细胞再生而来,因此,表皮干细胞可能成为构建组织工程皮肤的种子细胞,但目前我们对它还了解甚少.现就表皮干细胞的有关生物学行为包括一般特性、分布位置、表面标志物、可能的应用前景等方面的研究进展作一综述.
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毛囊干细胞的研究进展
毛囊干细胞是毛囊组织维持自我更新的基础,它具有干细胞的一般特征,普遍认为定位于毛囊隆突部.毛囊干细胞的标记物是分离和鉴定细胞的重要依据,在多种信号通路调控下可以分化为毛囊、皮脂腺和表皮.至此,毛囊干细胞在组织工程皮肤中的作用引起人们的关注,就毛囊干细胞的研究进展作一阐述.
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化学品刺激性组织工程皮肤检测模型的构建
目的构建检测化学品刺激性的组织工程皮肤模型.方法利用组织工程学方法,以牛胶原为支架,以人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞为细胞来源,构建检测用组织工程皮肤模型.选用10种化学品为检测物质.在刺激性检测实验中,10种化学品(固体10 mg、液体10 μL)局部接触检测模型表面15 min,用MTT方法测定细胞活力.结果以相对细胞活力值为判定刺激性的依据,在10种化学品中,构建的检测模型能够分辨7种化学品的刺激性.结论构建的组织工程皮肤模型能判定化学品的刺激性,可以尝试用于化学品刺激性的检测.
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组织工程皮肤的构建及组织形态学观察
背景:应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物.目的:建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察.方法:以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析.结果与结论:以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求.
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骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建组织工程皮肤修复糖尿病皮肤缺损
背景:小肠黏膜下层已经被证实可以引导许多组织的特异性再生.目的:将骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤并移植修复兔糖尿病皮肤缺损,观察其对糖尿病皮肤缺损的愈合影响和疗效.方法:制作兔糖尿病皮肤缺损,将骨髓间充质干细胞与冻干、灭菌、水合后的猪小肠黏膜下层膜复合制作组织工程皮肤并覆盖修复兔糖尿病皮肤缺损,并与小肠黏膜下层支架组和空白对照组做对照.结果与结论:造模后1,2,4 周,组织工程皮肤组缺损皮肤修复面积百分比显著大于小肠黏膜下层支架及空白对照组(P <0.05).缺损皮肤修复组织观察组织工程皮肤组组织生长明显快于小肠黏膜下层组与空白对照组.3 组均未见明显皮肤附件结构.表明骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤修复兔糖尿病皮肤缺损好于单纯小肠黏膜下层膜,无明显瘢痕组织的生成,可作为支架材料用于皮肤缺损的修复.
