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体外受精与体外培养对小鼠囊胚发育潜能的影响
目的 评估体外受精和体外培养对囊胚期胚胎细胞数及发育潜能的影响. 方法 (1)雌性ICR小鼠,自然交配获取囊胚为In vivo组,体内受精-体外培养获取囊胚为IVC组,体外受精获取囊胚为IVF组;(2)对三组囊胚行免疫杀伤法检测并在荧光显微镜下计数总细胞数、内细胞团细胞数、内细胞团与总细胞数的比值;(3)提取三组小鼠囊胚mRNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测Pou5f1等细胞因子的mRNA表达水平;(4)三组囊胚移植入D3.5假孕鼠,取D10.5胚胎进行形态学检测,计算胚胎植入率、成活率、流产率. 结果 (1)IVF组和IVC组囊胚与In vivo组相比,细胞总数、滋养外胚层(TE)细胞数、内细胞团(ICM)细胞数均显著降低(P<0.01),TE/ICM细胞数的比值三组之间无显著差异(P>0.05);(2)IVF组和IVC组囊胚与In vivo组相比,多潜能基因OCT4、Nanog、Sox2表达水平相对上调,而早期细胞命运分化相关基因Fgf4、Gata4、Sox17、Eomes、Elf5、Lif表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.05);(3)三组间胚胎植入率无显著性差异(P>0.05),而IVC组、IVF组活产率显著低于In vivo组,流产率显著高于In vivo组,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 体外受精会导致囊胚质量下降,并影响胚胎植入后的进一步发育,导致胚胎成活率降低.
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蔗糖预处理去核:一种可靠的无损害小鼠卵母细胞MII期核去除法
小鼠是发育生物学中为有用的实验动物模型,特别是在核移植方面.自从1983年Mc-Grath等[1]报道成功地进行小鼠的核移植以来,已采用小鼠的4-8细胞期的早期胚胎细胞[2]、桑椹胚[3]、内细胞团和滋养层细胞[4]以及体细胞[5]进行了核移植,并获得了后代.作为核移植的受体,可采用去核的合子[1],2-细胞期胚胎[6,7]和去核卵母细胞[8].其中以去核卵母细胞使用为广泛,它可接受各个时期以及不同类型的供体细胞[9].但MII期小鼠卵母细胞的核(纺锤体)不能在相差显微镜下观察到[10].
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新的囊胚活检方法——囊胚活检不再纠结和繁琐
囊胚活检目前是进行胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)以及单基因疾病诊断的前提.目前常规使用的提前打孔的囊胚活检方法,会出现囊胚孵出时间不确定、内细胞团处于孵出部位以及囊胚过早孵出等异常现象,给囊胚活检带来了一定的困难,并部分地影响到囊胚终移植的临床结局.新的非提前打孔囊胚活检法,利用透明带本身的束缚作用减少激光的创面,可以大程度地减少活检时异常情况的出现,使得活检更加简单并且可控,可以在一定程度上改善移植胚胎的临床结局.
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昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究
目的:探讨昆明鼠胚胎内细胞团分离方法、原代干细胞克隆分离时机及干细胞传代方法对干细胞建系效率的影响.方法:取昆明鼠3.5d囊胚建胚胎干细胞系,比较全胚培养法与免疫外科法两种内细胞团分离方法对胚胎干细胞建系效率的影响,观察原代克隆的分离时机,机械法传代和酶消化传代对胚胎干细胞建系效率的影响.结果:全胚培养法30个囊胚建系3个,免疫外科法32个囊胚建系4个,两组均可以有效地形成胚胎干细胞系;昆明鼠原代干细胞克隆分离佳时机是增殖4~6 d;5代以前的干细胞以机械传代方法较好,5代后用酶消化法传代效果较好.结论:全胚培养法和免疫外科法均能有效建立昆明鼠胚胎干细胞系,采用机械化与酶消化法相结合传代更适合昆明鼠干细胞建系.
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小鼠囊胚内细胞团的生长行为
胚胎干细胞[1](ES细胞)是由着床前内细胞团(ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养而建立的克隆细胞系.能够广泛的分化成各种组织细胞,具有潜在的科研及应用价值.
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用低形态学评分D3胚胎建立人胚胎干细胞系
目的 寻找人胚胎干细胞(hESC)建系材料来源.方法 选用IVF低形态学评分的D3胚胎行序贯囊胚培养,用免疫外科的方法去除滋养细胞,将得到的内细胞团(ICM)接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)上培养5~8 d,每4~7 d传代1次,分别取不同代的hESC进行碱性磷酸酶(AKP)染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原(TRA)TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内外分化全能性鉴定.结果 130枚废弃的D3低形态学评分(评分<16)的胚胎培养出囊胚19枚,获得原代克隆5个,成功培养出两株hESC系,它们具有hESC的共同的生物学特性.结论 部分低形态学评分的D3废弃胚胎可发育成囊胚.囊胚形成率与形态学评分相关,这些胚胎可作为建立hESC系的材料来源之一.
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兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清对8-细胞胚胎发育的影响
目的 制备兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清,观察其对小鼠胚胎发育的影响.方法 用小鼠胚胎培养基稀释兔抗血清,分别稀释至50倍、100倍、200倍,用其对小鼠8-细胞胚胎进行培养,通过胚胎致密化、囊胚率、胚胎体外贴壁生长、细胞计数、胚胎移植和免疫荧光染色观察胚胎发育状况.结果 形态学上50倍稀释的抗血清能够抑制8-细胞胚胎的发育甚至使其死亡;100倍稀释的抗血清能够延迟8-细胞胚胎的致密化,并使得胚胎在囊胚化过程中出现空泡化的现象;200倍稀释的抗血清作用不明显.未作免疫处理的兔血清与空白对照组差异不显著.100倍稀释的抗血清能够显著抑制囊胚内细胞团(ICM)的发育、囊胚细胞分布紊乱、胚胎细胞数目减少以及囊胚畸形率增加.虽然囊胚的碱性磷酸酶和Oct4均呈阳性,但经胚胎移植后都不能正常发育.结论 兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清能够抑制小鼠胚胎致密化过程和囊胚内细胞团的发育,使囊胚出现空泡化,细胞分布紊乱,抑制胚胎着床.
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肿瘤干细胞:从假说到科学的漫长之路
干细胞是有自我更新和复制能力的原始细胞,这种细胞可分化为特定组织中一个或者多个具有特定功能的细胞.在脊椎动物中,它常常被分为3种类型:第1种类型--胚胎干细胞(embryonic stem,ES),这种细胞来源于内细胞团(inner cell mass)细胞,被认为是全能的(totipotent stem cell),也就是说它具有向机体各种细胞分化的潜能.第2种是pluripotent stem cell,它可以分化成除了胎盘外的任何一种细胞.第3种是multipotent stem cell,它能够分化成特定功能的细胞,如造血干细胞能够分化成血液和免疫系统中的各种细胞;此外,肠道、皮肤、大脑和心脏等组织中也存在这种类型的干细胞.5年前,以造血干细胞为主的干细胞生物学研究还是一门非常局限的学科,近年来这方面研究已经拓展到急性心肌梗死、糖尿病、帕金森病和退行性神经病变等原来认为无法根治的疾病[1],其迅速的发展将对人类的健康事业产生巨大的影响.
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Nanog基因及其传导通路在保持胚胎干细胞多能性中的作用
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的研究早开始于1980年,当时鼠ES第一次被分离出来[1-2],ES来源于囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),可以自我复制并分化出其他胚层,这一特性对于细胞替代治疗、药物开发和自我修复治疗等研究具有重要的价值.近些年来人类ES的成功培养和分化受到了很大关注,它可以用于组织再生治疗和研究人类进化过程[3].
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干细胞的临床应用研究进展
干细胞(stem cells)是一类具有自我复制(self-renewing)能力的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能细胞.根据其发育阶段,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞.胚胎干细胞的分化和增殖构成个体发育的基础,即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体;而成体干细胞的进一步分化则是成体组织和器官修复再生的基础[1].当受精卵分裂发育成囊胚时,将内细胞团(inner cell mass)分离出来进行培养,在一定条件下,这些细胞既可在体外“无限期”的增殖传代,同时还保持其分化的全能性,因此被称为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞).胚胎动物生殖嵴部位的胚芽细胞(embryonic germ cells, EG细胞)同样具有自我复制和分化成各种功能细胞的能力,因此也隶属于胚胎干细胞.1998年,美国科学家Thomson等[2]和John Gearhart分别用人ES和EG细胞建立了胚胎干细胞系,为研究胚胎干细胞的发育和利用胚胎干细胞治疗疾病提供了广阔的空间[3].
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多能性干细胞与再生医学
在体内胚胎发育是一个连续的、时空精密调控的过程,伴随着受精卵的分裂、分化,终发育为一个包含多种细胞类型,并由多种细胞类型形成复杂组织结构的完整个体.将原本连续的胚胎发育过程中的特殊阶段维持下来,使其既能维持在自我更新水平,又能回归发育过程分化为其他类型的细胞,这种细胞称之为干细胞.有些类型的干细胞是发育中不存在的,人为的调控信号通路将其在体外维持下来,例如通过持续激活LIF-Stat3 通路和经BMP4 通路从早期囊胚内细胞团建立的胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES 细胞),通过调控成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF),activin通路从植入后胚胎的表胚层建立的表胚层干细胞[1];有些类型的干细胞在发育中存在,并作为"干细胞库"更新、修复组织,例如造血干细胞、毛囊干细胞等.
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基于诱导多能干细胞技术的疾病模型的构建及其在妇产科领域应用的研究进展
近年来,对干细胞的研究备受关注。1998年,美国威斯康星大学成功分离出世界上首株人胚胎干细胞(embryonic stem cell)[1],干细胞可分化为构成机体的所有细胞类型,理论上能形成任何组织和器官,甚至发育成完整个体,自此拉开了多能干细胞研究的序幕。2006年,日本科学家通过对4个多能基因--Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因(即OSKM基因)过度表达,逆转小鼠体细胞去分化也得到多能干细胞,并命名为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)[2]。这种形态类似胚胎干细胞的新型细胞,也同时具备自我更新和向3个胚层分化的多能干细胞的基本特征。由于无须从哺乳动物早期胚胎的内细胞团分离,iPSC技术的出现回避了胚胎干细胞带来的伦理学争议;同时,与其他类型干细胞相比,iPSC本身来源于自体体细胞,所以能够避免异体移植产生的免疫排斥反应。因此,iPSC技术的研究和应用前景越来越受到研究者和临床工作者的瞩目。
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造血和血管共同的祖细胞--血液血管干细胞
自从1998年第一次从内细胞团分离到人的胚胎干细胞,基于早期的小鼠胚胎干细胞可以分化为几乎所有三个胚层的细胞的研究,胚胎干细胞的全能性使人们很快认识到胚胎干细胞在再生医学中的潜在应用价值.人们相信干细胞的研究将带来临床治疗各种疾病的革命,如心血管疾病、神经退行性疾病,糖尿病及癌症等.
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胚胎干细胞途径获得基因工程小鼠的原理与方法
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell简称ES细胞)是从早期胚胎的内细胞团(Inner Cell Mass, MIS)分离出来的多潜能细胞系.它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能.在饲养层上或含有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)或分化抑因子(Differentiation inhibitory activity DIA)的培养基中培养时保持未分化状态,但在适当条件下被诱导分化.在这种细胞注入受体胚胎时,能参与各种组织器官发育,形成嵌合体[1~4].
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Fgf4信号通路在早期胚胎发育过程中的作用
囊胚的形成,内细胞团?(inner cell mass,ICM )及滋养外胚层(Trophectoderm,TE)的形成是胚胎的第一次分化事件,而第一次的细胞命运决定则是大约在32-细胞阶段才确定的.在囊胚形成的过程中参与细胞命运决定的可能转录因子有Fgf4(成纤维细胞生长因子4,Fibroblast GrowthFactor 4)、Fgfr2( Fibroblast Growth Factor receptor2, 成纤维细胞生长因子受体2)、Cdx2(caudal homeobox Transcription Factor 2 ,尾型同源盒转录因子2)、Tead4(TEA域家族成员4,TEA domain family member4)、Sox2 (SRY--sex-determining region Y box 2)、Oct4(Octamer-4,OCT3 /Pou5f1)等.本文主要综述FGF4信号通路有关的一系列因子在这一过程中的作用的研究进展.Murohashi M 等人提出在早期胚胎F G F4信号通路中各因子相继产生作用,它们之间的可能的关系为FGF4-FGFR2-FRS2a(FGFR2的底物)-E R K(促分裂原激活的蛋白激酶)-Cdx2,而Fgf4的表达受到Sox2/Oct4的协调调控表达,因此可以改为Sox2/Oct4-FGF4-FGFR2-FRS2a-ERK-Cdx2.
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059来自体细胞克隆的人多能胚胎干细胞建系成功
自从1996年克隆绵羊多利的诞生和1998年人类胚胎干细胞第一次被分离出来,一直试图将两种技术结合起来,制造一种胚胎干细胞(ES细胞),这种干细胞带有与某个患者完全一样的基因组,随着细胞的分化,能被用来组织修复和器官移植而无免疫排斥,即治疗性克隆技术.以往报道人的ES细胞都是来自辅助生殖技术中获得的囊胚的内细胞团.首次报道通过人类体细胞核移植(SCNT)得到的人ES细胞.
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胚胎植入机制的研究进展
从受精卵形成到胚胎发育再到妊娠分娩完成,母体和胎儿均经历许多复杂的变化,其中,早期胚胎植入过程对于整个妊娠过程的影响尤为重要.近来由于分子和遗传学技术的进步,人们发现了大量参与胚胎-子宫相互作用的分子.本文就几个目前看来较为重要也较为清楚的信号通路做一简要综述.
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人胚胎干细胞分化研究进展
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ES细胞)是由着床前囊胚期内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)建立的、可在体外未分化状态下长期增殖传代的、具有稳定的二倍体核型和多能干细胞表面特异抗原标记的、可分化为3个胚层来源的各种组织和细胞类型(包括生殖腺和生殖细胞)的永久细胞系.基于其特性,目前普遍认为,.ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,新基因的发现,药物的筛选和致畸实验及作为细胞组织移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响.本文综述了人胚胎干细胞诱导分化研究进展.
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昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较
背景:远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的佳方法和适合的采胚时间.方法:采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论:免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著(P > 0.05);全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法(P < 0.05),但原代克隆形成率显著低于免疫外科法(P < 0.05);全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚(P < 0.05);免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚(P < 0.05).结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.
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体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞佳胚龄的筛选:孕2.5 d与3.5 d及4.5 d比较
背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道.目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的佳胚龄.方法:分别从孕2.5 d,3.5 d和4.5 d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色.结果与结论:孕2.5 d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚.孕2.5 d胚胎和孕3.5 d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P>0.05);孕4.5 d胚胎上述指标均显著高丁二前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料.