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哺乳动物体细胞克隆及在动物转基因中的应用
哺乳动物体细胞克隆及转基因技术,近些年发展迅速.尤其1997年'多利'羊的诞生,对推动哺乳动物克隆及转基因技术的发展具有里程碑式的意义.本文介绍了哺乳动物体细胞克隆的方法,存在的问题和体细胞克隆的机理研究.对这些方法和研究理论进行了讨论,并探讨如何利用克隆技术进行转基因动物的制备.
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给科学一个健康发展的空间 --"黄禹锡事件"引发的思索
2006年1月10日,韩国首尔大学"黄禹锡科研组干细胞成果"调查委员会发布终报告,宣布韩国科学家黄禹锡伪造了所有克隆体细胞的证据,黄禹锡于2004年和2005年在<科学>杂志上先后发表的有关"利用卵子成功培育出人类胚胎干细胞"、"利用患者体细胞克隆胚胎干细胞"的研究均系编造而成.美国<科学>杂志12日正式宣布,撤销黄禹锡等人两篇被认定造假的论文.11日,韩国政府决定取消黄禹锡"韩国高科学家"称号,并免去他担任的一切公职.
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059来自体细胞克隆的人多能胚胎干细胞建系成功
自从1996年克隆绵羊多利的诞生和1998年人类胚胎干细胞第一次被分离出来,一直试图将两种技术结合起来,制造一种胚胎干细胞(ES细胞),这种干细胞带有与某个患者完全一样的基因组,随着细胞的分化,能被用来组织修复和器官移植而无免疫排斥,即治疗性克隆技术.以往报道人的ES细胞都是来自辅助生殖技术中获得的囊胚的内细胞团.首次报道通过人类体细胞核移植(SCNT)得到的人ES细胞.
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解读来自各个方面的不同声音
当今,关于克隆人,关于生殖性克隆与治疗性克隆,仍是科学界、社会舆论和一些政要讨论的热门话题.今年1月在北京召开的"北京国际生命伦理学学术会议",同样再现了这一争论的情景.据韩国学者在会上透露,韩国正准备通过一项<生命伦理与安全法>,全面禁止克隆人.根据这项法令,对违反这一规定的人将处以十年的徒刑.国家原则上禁止体细胞克隆,禁止人畜细胞融合的研究.国家将设立专门委员会,对基因复制、人体受试者研究,实行严格的检查.当然,来自其他一些国家的学者,也反映了这些地区支持克隆、支持胚胎干细胞生殖性研究的意见.即使在韩国,也不只是一种声音.据称,韩国的商界,是积极支持克隆技术研究的坚实力量.
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家畜体细胞克隆中核重编程机理研究进展
体细胞克隆在绵羊、山羊、牛、猪等家畜中获得了成功,但目前的克隆效率非常低.克隆效率低使家畜体细胞克隆技术在畜牧业生产及其他领域的应用受到极大的限制,问题的根源在于对体细胞克隆中核重编程的分子机理缺乏了解.供体细胞核移入去核的卵母细胞后,必须经过后成表观遗传修饰的重编程,从而恢复供体细胞核的全能性,才能保证重构胚的正常发育及个体的正常生长.本文从移植核的重构、DNA甲基化总体改变、组蛋白修饰、X染色体失活、端粒长度和端粒酶活性恢复、印迹基因及其他与发育相关基因的表达及核重编程的影响因素等几个方面探讨了体细胞克隆中的核重编程机理,为克隆效率提高的方法研究提供理论依据.
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DNA甲基化与重构胚的发育
目前体细胞克隆已经取得较大进展,但平均效率还不到5％,仍面临着许多障碍,如重构胚胎在发育各个阶段的死亡率非常高,且后代常出现畸形等.究其原因可能与重构胚的细胞核重编程异常有关.细胞核的重编程异常表现为不同程度的表观遗传修饰异常.表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、基因印记、X染色体失活、端粒、组蛋白修饰等,其中DNA甲基化起重要作用[1].正常的DNA甲基化能改善供核细胞的重编程,从而提高核移植的成功率.
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表观遗传修饰剂对重构胚发育的影响
自从"Dolly"绵羊克隆成功后,先后有哺乳动物鼠、猪、牛、狗、马等克隆成功的报道,但目前哺乳动物体细胞核移植成功率仍很低,其主要与卵母细胞对供体核的不完全重编程有关.核重编程主要表现为供体核基因的表观遗传改变并指导重构胚胎的正常发育.在核移植过程中,体细胞(供核细胞)携带着其组织所特有的表观遗传修饰标志,这种标志在核重编程中必须被清除.去除供核细胞先前的表观遗传标志能够提高重构胚的体外发育率[1].在核重编程中假如表观遗传修饰标志清除或重建失败,将导致重构胚全能性消失、从而影响后期分化和发育[2].核移植后供体细胞核的重新程序化是否完全是成功产生克隆动物的先决条件[3].表观遗传修饰主要包括3个方面:DNA甲基化,RNA相关性沉寂和组蛋白翻译后修饰,其中DNA甲基化和组蛋白乙酰化在体细胞核移植中研究较多.DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达;组蛋白乙酰化与基因活化以及DNA复制相关,组蛋白的去乙酰化和基因的失活相关.在体细胞克隆过程中加入适量的表观遗传修饰剂,干预DNA甲基化和组蛋白乙酰化过程,将有可能影响重构胚的体内外发育.
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体细胞克隆巴马小型猪部分生理生化指标的初步测定
目的 探讨体细胞克隆巴马小型猪的生理生化指标特性.方法 采用全自动血球计数仪和全自动生化仪,对体细胞克隆巴马小型猪血液的部分生理和生化指标进行测定和分析.结果 体细胞克隆巴马小型猪生理生化指标和同期普通巴马小型猪没有显著差异,与人类大部分指标接近.结论 体细胞克隆巴马小型猪和人类的生理生化特性有一定的相似性.
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克隆波尔山羊的微卫星DNA鉴定
目的:利用微卫星DNA技术进行体细胞克隆后获得个体的鉴定.方法:提取正常山羊、供核波尔山羊、本地受体山羊及克隆个体的基因组DNA,通过设计微卫星DNA多态PCR引物扩增微卫星DNA序列并对之进行微卫星DNA鉴定.结论:通过微卫星DNA序列的扩增,证明克隆个体为供核波尔山羊的克隆.
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新世纪寄语
本刊编者 人类社会已迈入一个新的世纪。当今世界，科技革命方兴未艾，创新浪潮波涛汹涌。科学技术空前深刻的影响着人类的生产、生活方式，推动着经济社会的变革和发展。知识已成为重要的生产要素和经济增长的重要依托，科技实力和创新能力越来越决定着一个国家的地位和尊严。 2001年2月12日，中、美、英、德、日、法6国和美国Celera Genomics公司联合公布了较之2000年6月人类基因组计划(Human Genome Project)完成的人类基因组“工作框架图”更加准确、更加清晰、更加完整的基因组图谱以及对它的初步分析结果。这一重大成果是人类在新世纪的第一个春天里奉献给全世界的一份丰厚的礼物，标志着生命科学又向纵深迈出了划时代的一大步。 随着人类基因组计划的接近完成，人们的注意力已开始转向蛋白质。一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，展现在人们面前的有关人类蛋白组学的研究将是更加艰巨和复杂的课题。因为，虽然人们已了解了整个基因的序列，但迄未鉴别出所有的基因及其所表达的蛋白质，所以，要识别出人体内可能存在的几十万种以上的蛋白质并确定它们的功能，决非易事。而蛋白组的研究结果，必将进一步导致疾病诊断、新药开发等方面的实质性突破，从而使生命科学研究能够实现其在防治包括癌症、艾滋病、心脑肺血管病等各种疑难危重疾病和促进人类健康、长寿等方面的终目标。 新的科研成果为人类带来了新的希望，但也使人类面临新的挑战。当前，生命科学确实已经或正在开启着人类历史的新纪元，并将成为21世纪的支柱产业，为全人类造福；然而，它又有可能成为一把双刃剑，给人类社会带来负面影响。因此，人们应当增强有别于其它生物的自控能力，通过制订法律、公约和伦理、道德规范来约束自己。今年1月22日，英国上院通过法律，同意利用人体细胞克隆早期胚胎(6～7天)，从中提取胚胎干细胞；2月7日，德国政府内阁会议将“生命科学”列为主要议题，并决定2001年为“生命科学年”，列为今年政府的工作重点。由于生命科学涉及多种学科和产业领域，具有尚难估量的巨大的市场前景，所以许多国家都想抢占这一领域。这也为我们传达了某种启迪和借鉴。我们应当充分发挥自己的优势，力争在生命科学领域有所作为。
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体细胞克隆哺乳动物胚胎发育的表观遗传学
如何提高克隆效率和体细胞核移植后表观遗传重编程的潜在机制的研究是当前生命科学的热点之一.将处于分化状态而进行核移植的体细胞转变成具有全能型的早期胚胎的关键是表观遗传的重编程.文章从基因印迹,X染色体失活,端粒长度等方面来探讨哺乳动物克隆胚胎在发育过程中的表观遗传重编程的机制.
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转人CD59基因的猪胚胎成纤维细胞的建立
补体介导的超急性排斥反应(HAR)是异种移植成功应用的主要障碍.CD59是一种补体活化调控蛋白,具有良好的抗超急性排斥反应作用.通过对猪胚胎成纤维细胞进行基因修饰,体细胞克隆,有希望克服上述问题.
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小鼠卵母细胞电激活的实验研究
目的寻找用电激活方法作小鼠体细胞克隆的适宜卵龄的卵母细胞及电激活参数.方法在0.6 kV/cm、80μs、2个电脉冲(2 p)下,比较了注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)后13、16、19、22 h卵母细胞的激活率、碎裂+死亡率.在上述相同电脉冲下,统计了经体外培养(IVC)和新鲜的卵龄为16、19、22 h的卵母细胞的激活率,碎裂+死亡率;比较了场强分别为0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 kV/cm,电压时程分别为10、20、40、80、100、150、200μs,2 p对注射HCG后16 h卵母细胞的电激活效果.结果注射HCG后16、19 h卵母细胞电激活率较高,分别为63.6%和76.7%,经体外培养后激活率下降,碎裂+死亡率明显增加.在0.9 kV/cm、80/100μs,2 p时激活率达70%～80%.在1.2 kV/cm、40/80/100μs、2 p时,激活率达到了80%左右,碎裂+死亡率低于16%.结论注射HCG后16 h的卵母细胞为适宜的小鼠核移植的受体细胞.0.9 kV/cm、80/100μs,2 p及1.2 kV/cm、40/80/100μs、2 p为适宜的电激活参数.
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不同分化状态的供体细胞对小鼠克隆胚胎发育的影响
目的:探讨不同分化程度的供体细胞对克隆胚胎发育潜能的影响.方法:采用"一步法"核移植技术将供体细胞核直接注入小鼠卵母细胞,成功构建克隆胚胎.颗粒细胞克隆胚胎经含有10 mmol/L的SrCl2和5 ug/mLCB的培养液中激活处理5～6 h,R1胚胎干细胞克隆胚胎经含有10 mmol/L的SrCl2的培养液中激活处理3h,然后移入CZB培养液中继续培养.结果:颗粒细胞克隆胚胎体外的激活率、卵裂率和囊胚率与胚胎干细胞克隆胚相比具有显著差异,克隆胚胎体内移植后胚胎干细胞克隆胎儿出生率稍高(2.3%vs.1.2%),但没有显著差异.结论:供体细胞分化程度越低,克隆胚胎体内外发育潜能越高.
