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新分子细胞生物学方法与技术研究进展
分子细胞生物学是从20世纪60年代迅速发展起来的一门新兴学科,通过对细胞核以及细胞质内的各种超微结构及其功能更为直观的认识,尤其是从分子水平上对其进行深入的探讨,使得分子细胞生物学日臻完善,并且也成为研究生命科学的重要技术.在医学研究领域,体细胞核移植、干细胞定向诱导分化、细胞重编程(特别是诱导性多潜能干细胞技术)的研究为我们制备体外疾病模型、研究疾病发生机制、寻求细胞及组织移植的新材料方面提供了重要的技术支撑.
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治疗性克隆与体细胞重编程:殊途同归
治疗性克隆和体细胞重编程是制备患者特异性自体干细胞的两种不同策略,近期已取得了重大的研究进展.治疗性克隆是通过体细胞核移植后形成克隆囊胚进而获得胚胎干细胞,体细胞重编程则是将特异性转录因子导入到体细胞核中而建立诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞).两者在方法学路径、技术难题、伦理争议等方面各不相同,但在应用研究层面上都涉及到干细胞的定向诱导分化、细胞移植治疗等相同的问题.本文总结了这两种生物技术的研究进展及其异同点.
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不同电融合和激活参数对猪体细胞核移植胚胎发育的影响
目的:摸索猪体细胞核移植佳的融合和激活条件.方法:利用体外成熟的去核猪卵母细胞为受体,颗粒细胞为供核细胞,透明带间隙注射法构建重构胚,对电融合和激活的参数(电场强度、脉冲宽度、脉冲次数、融合液中Ca2+浓度、联合激活参数)进行摸索.结果:发现在电场强度1.5 kV/cm,脉冲宽度30 μs,2次脉冲(间隔3 s),电融合液中0.1 mmol/L的Ca2+浓度下进行电激活,进而用(CB,7.5 μg/ml)+(6-DMAP,2 mmol/L)激活3.5 h发育率高,48 h卵裂率为72.5%,第6天桑葚胚率为35.1%;初次尝试了在胚胎培养前48 h加入0.05 mol/L的甘露醇来增加渗透压以减少电激活后重构胚的碎片化程度,但发现卵裂率及桑葚胚发育率与对照组差异不显著.结论:初步得到了适宜的猪体细胞核移植的融合和激活条件,为随后克隆胚早期发育基因的研究打下了基础.
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细胞命运的逆转:体细胞核移植与诱导多能干细胞——2012年诺贝尔生理学或医学奖简介
2012年诺贝尔生理学或医学奖分别颁发给来自英国的John B.Gurdon和日本的Shinya Yamanaka两位科学家,以表彰他们在“成熟细胞可重编程而具有多能性”方面的重大发现.他们开创性的工作改变了人们对于细胞或生物体发育程序的传统观念,促使人们去探寻逆转细胞发育命运的奥秘.
关键词: 体细胞核移植 诱导多能干细胞 发育 重编程 诺贝尔生理学或医学奖 -
实验用小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞为核供体生产转基因克隆胚胎
目的 比较不同类型体细胞对生产转基因克隆胚胎效率的影响.方法 利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染到五指山小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞,经过G418筛选后均获得了阳性细胞株.然后分别以两种类型转基因细胞以及未转基因细胞为核供体进行体细胞核移植,比较不同类型供体细胞克隆胚胎的囊胚发育率.结果 胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞克隆胚的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,8.3% vs.7.1%);转基因胎儿成纤维细胞(9.6%)和转基因骨髓间充质细胞(9.9%)克隆胚胎的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,9.6%vs.9.9%);每一种类型供体细胞转基因与否对克隆胚的囊胚发育率无影响(P>0.05).结论 通过体细胞核移植技术,小型猪骨髓间充质细胞与胎儿成纤维细胞均可有效地生产转基因囊胚.
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治疗性克隆与造血干细胞移植
干细胞研究及其在临床的应用是21世纪生命科学研究的主要目标之一.造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)是目前研究为清楚的一种成体干细胞,HSC移植在临床上已成功应用,并取得了巨大的社会效益和经济效益.然而,细胞来源不足、移植后需要终生服用免疫抑制剂及其所带来的一系列严重的并发症极大地限制了该技术在临床的广泛开展.胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)因其体外无限增殖能力和"分化全能性"而成为未来再生医学中的重要种子细胞来源.通过体细胞核移植(somatic-cell nuclear transfer, SCNT)技术获得克隆胚胎,建立患者遗传特异性的ES细胞系,体外诱导ES细胞分化成HSC,应用于临床移植,这样不仅可以避免很多伦理学问题,方便获得充足的功能细胞来源,还可以避免移植后的免疫反应,提高移植的成功率,因此ES细胞在临床的应用可能会首先在HSC移植上取得突破.
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人自体胚胎干细胞创建技术的研究进展
体细胞核移植和生殖细胞单性生殖技术是灵长类动物自体胚胎干细胞自体遗传背景构建的主流技术,目前还存在明显的"低效率"问题.原因主要是重构卵后天获得性重新编序不完全/不恰当/不完善、重构卵纺锤体组分的种系特异性丢失/非整倍体核型形成、或重构卵缺少父源性或母源性基因印记的影响.今后应从促进所需的后天获得性基因重新编序、避免重构卵所需组分的丢失、减少非整倍体核型的形成和校正亲代基因印记的偏倚等方面开展相关的研究和应用.
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059来自体细胞克隆的人多能胚胎干细胞建系成功
自从1996年克隆绵羊多利的诞生和1998年人类胚胎干细胞第一次被分离出来,一直试图将两种技术结合起来,制造一种胚胎干细胞(ES细胞),这种干细胞带有与某个患者完全一样的基因组,随着细胞的分化,能被用来组织修复和器官移植而无免疫排斥,即治疗性克隆技术.以往报道人的ES细胞都是来自辅助生殖技术中获得的囊胚的内细胞团.首次报道通过人类体细胞核移植(SCNT)得到的人ES细胞.
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体细胞核移植技术在医学中的应用
近几年来体细胞核移植技术取得了重大的突破,具轰动的是克隆绵羊"Dolly"的问世,这是世界上第一例由成体细胞核移植后出生的哺乳动物,打破了体细胞不具备发育成新个体能力的传统认识,创新了一直沿用早期胚胎细胞进行核移植的方法.本文综述了体细胞核移植技术的研究进展、技术方法,以及它在医学领域巨大的应用价值和前景.
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人类胚胎干细胞的研究近况
人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES)研究始于1998年,它已成为继人类基因组计划后生命科学中活跃的研究领域.利用hES细胞修复或替代因各种因素所造成的人体组织器官缺损和功能障碍是人类疾病治疗模式划时代的革新.用于细胞替代治疗的hES细胞必须具备安全性、有效性、免疫豁免性三大特点,因而很多研究集中于以下课题:(1)纯化hES细胞培养环境,避免动物源性物质的污染.(2)hES细胞诱导分化为各种成体细胞及其前体细胞以及移植.(3)体细胞核移植与hES细胞系的建立.(4)hES细胞与基因治疗.
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核移植供体细胞中心体遗传的研究进展
中心体作为动物细胞主要的微管组织中心,在微管成核过程以及纺锤体两极的建立起重要作用.来源于供体细胞的中心体成分参与了核移植重组胚瞬间纺锤体和第一次有丝分裂纺锤体组装,是维持正常纺锤体功能所必需.核移植后中心体功能是否正常是影朐染色体组和胚胎后期发育的重要因素.中心体蛋白包括γ-tubulin、核有丝分裂器蛋白(nuclear-mitotic apparatus protein,NuMA)在核移植后纺锤体组装中发挥重要作用.
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不同融合方式对核移植后胚胎融合的影响
目的 本文是通过对核移植后胚胎融合时不同排队方式的影响进行研究,试图提高重构胚胎的融合率,以提高核移植的效率.方法 采用手动排队和交流电+手动方法两种不同的排队方式,将体细胞核移植后胞质体-核质体复合体融合.结果 体细胞核移植后得到的胞质体-核质体复合体融合时,采用手动和手动+交流电两种方法调正胞质体-核质体复合体,其融合率分别为38.5%和75.7%.结论 在核移植后胞质体-核质体复合体融合时,采用交流电+手动排队融合率明显高于手动排队.
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电脉冲对不同卵龄的MⅡ期卵母细胞激活影响
目的 研究电脉冲对不同卵龄小鼠MⅡ期卵母细胞电激活影响,寻找小鼠体细胞克隆避免电激活的适宜卵龄的卵母细胞.方法 在180V/mm,9 s,1个电脉冲(1p) 下,比较了注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后13,16h卵母细胞经体外培养(IVC)4h的激活率、碎裂+死亡率.结果 hCG后13h和16h的MⅡ期卵母细胞相比,激活率分别是6.2%和29.5%,两者间差异有极显著性意义(P<0.01).碎裂+死亡率两组间没有显著性差异.结论 注射hCG后13h 的卵母细胞为适宜的小鼠核移植的受体细胞,在一定程度上可以有效的避免电激活重构胚.
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电脉冲对不同卵龄的MⅡ期卵母细胞激活影响
定程度上可以有效的避免电激活重构胚.
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表观遗传修饰剂对重构胚发育的影响
自从"Dolly"绵羊克隆成功后,先后有哺乳动物鼠、猪、牛、狗、马等克隆成功的报道,但目前哺乳动物体细胞核移植成功率仍很低,其主要与卵母细胞对供体核的不完全重编程有关.核重编程主要表现为供体核基因的表观遗传改变并指导重构胚胎的正常发育.在核移植过程中,体细胞(供核细胞)携带着其组织所特有的表观遗传修饰标志,这种标志在核重编程中必须被清除.去除供核细胞先前的表观遗传标志能够提高重构胚的体外发育率[1].在核重编程中假如表观遗传修饰标志清除或重建失败,将导致重构胚全能性消失、从而影响后期分化和发育[2].核移植后供体细胞核的重新程序化是否完全是成功产生克隆动物的先决条件[3].表观遗传修饰主要包括3个方面:DNA甲基化,RNA相关性沉寂和组蛋白翻译后修饰,其中DNA甲基化和组蛋白乙酰化在体细胞核移植中研究较多.DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达;组蛋白乙酰化与基因活化以及DNA复制相关,组蛋白的去乙酰化和基因的失活相关.在体细胞克隆过程中加入适量的表观遗传修饰剂,干预DNA甲基化和组蛋白乙酰化过程,将有可能影响重构胚的体内外发育.
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融合条件对小鼠体细胞核移植融合率的影响
目的 提高小鼠体细胞核移植过程中融合效率.方法 使用CRY-3型和CE-450型细胞融合仪对B6D2F1小鼠去核卵母细胞与该品系小鼠胎儿成纤维细胞构成的重构胚进行融合,通过PEG/DMSO对供核细胞的预处理,比较了不同融合液,不同电极形状融合槽和供核细胞代次对融合率的影响.结果 (1)以PEG/DMSO对供核细胞预处理5 min的融合率显著高于同条件下未处理组(51.11%vs 25.64%)(P<0.05);(2)融合液中含0.1 g/L聚乙烯醇(PVA)组的融合率高于无PVA组;重构胚在甘露醇浓度为0.32 mol/L融合液中的融合率(48.21%)高于其他甘露醇浓度组(27.78%,41.67%和30.11%);(3)使用针状电极融合槽时的融合率(42.31%,43.13%)高于同条件下平行丝状电极融合槽组(30.43%,33.33%),其中又以在2 000 V/cm,20μs,2个脉冲时,交流电预处理30 s组高(43.13%);(4)供核细胞传代一次后融合率随着传代次数的增加而下降.结论 通过PEG/DMSO对供核细胞进行预处理,并在融合液中添加PVA时,结合优化的融合条件可以提高小鼠体细胞核移植过程中融合率.
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蚜肠霉素处理及细胞传代数对小型猪体细胞核移植胚胎发育的影响
目的 为优化小型猪体细胞核移植技术(SCNT)技术,探讨供体细胞不同类型、不同传代数以及蚜肠霉素(Aphidicolin,APC)处理各供体细胞对重构胚体外发育的影响.方法 小型猪输卵管上皮细胞(OEC),耳成纤维细胞(EFC)和卵丘细胞(CC)分别经血清饥饿或血饥饿后再使用0.1μg/mlAPC处理.核移植重构胚体外培养7d,以检测其发育能力.结果 OEC经APC处理后,重构胚的卵裂率和囊胚形成均显著高于仅血清饥饿处理组(61.82% vs 56.25%,24.55% vs 17.86%; P<0.05).以EFC为供体细胞,APC组重构胚卵裂率显著高于血清饥饿组(63.36% vs 57.01%; P<0.05).注入CC,APC处理能显著提高重构胚的囊胚形成率(29.63%; P<0.05).三种细胞经APC处理,CC作为核供体,重构胚的卵裂率和囊胚形成率高.三种细胞中,无论哪一种作为核供体,其传代数对重构胚的发育没有影响.结论 以CC为供体细胞,血清饥饿后再使用APC处理,更适合小型猪的体细胞核移植.
关键词: Aphidicolin 小型猪 细胞类型 传代数 体细胞核移植 -
小型猪克隆胚的构建及胚胎移植研究
目的 建立小型猪的体细胞核移植技术,为开展转基因小型猪动物模型研究提供技术支撑.方法 应用体细胞核移植技术,以小型猪胎儿成纤维细胞和枫泾猪耳成纤维细胞作为供体细胞进行体细胞核移植,并将两种重构胚混合后进行胚胎移植.结果 两种供体细胞在体外发育能力上无显著差异(P>0.05);电融合后进行化学激活能部分提高囊胚发育率,但差异不显著(P>0.05).两种方法生产的小型猪和枫泾猪克隆胚胎混合后,经胚胎移植均能顺利产下4只健康后代.经微卫星亲缘关系鉴定,克隆猪100%与供体细胞相同,与代孕母猪无关.结论 建立的克隆平台能够用于克隆猪的生产.
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体细胞核移植技术进展
转基因动物的研究和生产是动物胚胎工程中诱人和有发展前景的课题之一.早期用受精卵原核内注射外源基因和利用精子作为载体将外源基因导入受精卵的方法,其缺点是整合效率低,而且很难实现定点整合,出生的转基因动物外源性基因的表达也不稳定[1].著名的多丽羊的诞生使体细胞核移植技术成为一种新的生产转基因动物的方法.
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TSA对组蛋白乙酰化及体细胞核移植的影响
通过体细胞核移植技术获得重构胚胎,在卵母细胞内多种重编程因子的作用下,供体细胞核抹去分化状态,恢复全能性,即核重新编程的过程.在这个过程中,供体核必须被正确激活与胚胎发育密切相关的基因,同时抑制与分化有关的基因.到目前为止,通过该项技术已经获得了多种哺乳动物的克隆后代,但克隆成功率低,且存活个体大多表型异常.核重编程的不准确性可能是克隆后代存在高死亡率和发育异常的主要原因之一.基因组DNA甲基化、组蛋白乙酰化状态是影响重编程的重要因素.该文主要就组蛋白乙酰化的生物学功能,组蛋白去乙酰化酶抑制荆Trichostatin A对组蛋白乙酰化状态的影响,以及Trichostatin A在体细胞核移植中的应用作以综述.
关键词: 重编程 体细胞核移植 组蛋白乙酰化 TrichostatinA