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腺相关病毒载体研究进展
腺相关病毒作为基因治疗的载体,具有感染范围广,可长效稳定地表达外源基因,可定点整合至宿主基因组等诸多优点而备受青睐.近年来,有关腺相关病毒及重组腺相关病毒的生物学特点有不少研究进展,本文就此做一综述.
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杀菌蛋白DNA改组的初步研究
目的运用DNA家族改组方法提高杀菌蛋白(BPI23)的杀菌活性. 方法首先将人、猴、兔BPI23基因的PCR产物等量混合,用DNAaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物2步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得改组文库.应用Flp-InTM定点整合表达系统,将BPI23改组文库插入CHO细胞基因组中1个单拷贝位点,分别检测各个细胞克隆的杀菌活性,从中筛选高活性的BPI23改组分子. 结果经过2轮改组和筛选,共获得4个活性高于人BPI23约4倍的克隆,它们与人BPI23基因有7～13个氨基酸的变化. 结论探索了在CHO系统中进行DNA改组和筛选的方法与技术路线,成功进行了杀菌蛋白的改组,并为其它分子的改组提供了借鉴.
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重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响
目的:观察以重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制和表达的影响.方法:将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的2个ITR(inverted terminal repeat,ITR)之间,之后接有HBV的基本核心启动子(bacic core promoter,BCP)及其驱动的AAV的Rep基因,构成rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体,转染HepG2.2.15细胞(肝细胞性肝癌细胞插入乙型肝炎病毒基因),测定上清液中第1天、第2天、第3天及第10天HBsAg、HBeAg 表达及HBV DNA拷贝数,并对细胞基因组AAVS1区域进行测序.结果:成功构建了含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322-324、PLRBR522-324、PLRBR322-2424、PLRBR522-2424.体外质粒转染细胞实验显示4个载体对HBsA g、HBeAg表达及HBV DNA复制均有抑制效应,且前两者对HBsAg高一些、后两者对HBeAg高一些,第3个对HBV DNA拷贝数高一些.转染后第3天后抑制效应明显,第10天抑制率仍较高.针对细胞基因组AAVSl区域测序结果显示,目的序列定点整合于该区域.结论:利用AAV和HBV各种元件构建的rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,借助Rep蛋白介导的定点整合作用,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题做了一些技术上的探索.
关键词： RNA干扰 短发夹RNA rAAV HepG2.2.15细胞 定点整合 -
基因治疗靶向方法的研究进展
靶向基因治疗是指将目的基因通过载体系统导入机体,并特异性地在靶组织细胞中以可调控的方式表达,达到治疗疾病的作用而不影响其他正常细胞、组织或器官的功能.自1990年第1例基因治疗应用以来,基因治疗技术已在遗传、代谢病和肿瘤等领域取得了较快的研究进展.但迄今为止,基因治疗的安全性和有效性仍是有待突破的"瓶颈".其中,基因治疗的靶向性是安全有效地进行基因治疗的技术关键和研究热点.目前应用于基因治疗的靶向方法主要有:基因的靶向转移、靶向表达、原位修复和RNA干扰技术定点整合等.为此,现就有关问题进行综述.
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新型CHO/dhfr-细胞定点整合和表达系统的建立
目的:建立CHO/dhfr-细胞的定点整合和表达系统.方法:利用常规分子生物学方法,构建了一个新的高效筛选表达载体,该载体含有一个由FRT(flp recombination target)位点、报告基因(LacZ)及筛选基因(zeocin)三片段构成的融合基因,而且该基因的表达受一个弱化的SV40启动子的控制.借助于随机整合及高效筛选,实现FRT位点在CHO/dhfr-细胞基因组中转录活跃区的整合,然后利用该位点介导的特异性重组实现了目的基因(单链抗体-尿激酶融合基因)的定点整合和有效表达,而且随后通过DHFR/MTX系统的加压扩增,以提高单链抗体-尿激酶融合基因在宿主细胞中的表达水平.结果与结论:获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系,并利用该细胞系实现了单链抗体-尿激酶融合基因的高表达,表达量达到5 μg/(106细胞·24 h).
关键词： CHO/dhfr-细胞 flp-FRT重组系统 定点整合 基因表达 -
重组复杂蛋白快速表达体系的建立
目的 建立重组复杂蛋白快速表达体系.方法 利用定点整合技术建立定点整合宿主细胞库,分别以X-Fc融合蛋白和人凝血因子Ⅷ(FⅧ)为研究对象进行定点整合转染和表达分析.结果 通过定点整合转染建立了高表达的宿主细胞库；X-Fc融合蛋白和人FⅧ均在宿主细胞中获得了高表达,X-Fc融合蛋白的表达量为220 mg/L,人FⅧ在有血清培养条件下的酶活性为2 IU/ml,且细胞株表达稳定,易于扩大培养.结论 已成功建立了基于CHO细胞定点整合的重组复杂蛋白快速表达体系,该体系在克隆效率和时间上具有很大优势,可实现蛋白的有效快速表达.
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Rep蛋白介导的定点整合研究进展
建立安全可靠的、治疗基因能长期表达的系统是基因治疗的重要目标,这一目标可以通过促进目的DNA序列定点整合至宿主基因组的特定位置而达到.腺相关病毒的非结构蛋白Rep与顺式元件联合运用可以介导外源基因定点整合至人类基因组19号染色体AAVS1位点,本文就Rep蛋白的特性、介导整合机制及近年来在介导定点整合方面的研究作一综述.
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腺相关病毒新血清型的研究及其在肝病中的应用
腺相关病毒(AAV)是一种单链DNA依赖性病毒,属细小病毒科.AAV基因组有两个开放性读码区Rep和Cap,Rep包含P5启动子和P19启动子.P5启动子有两种RNA转录产物,编码生成Rep78蛋白和它的剪接异构体Rep68蛋白,在病毒复制、基因表达调控及宿主染色体定点整合中起重要作用.
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采用定点整合表达技术构建t-PA表达CHO工程细胞株
运用Flp-InTM定点整合表达系统构建表达组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)的CHO工程细胞株.将pcDNA5/FRT载体和携带t-PA基因的pJOD-S载体用Hind/Kpn I双酶切,再将回收的2.Okb t-PA cDNA片段和pcDNA5/FRT载体连接,构建pcDNA5/FRT/t-PA质粒;应用Flp-InTM定点整合表达系统,将t-PA cDNA定点插入Fl-lnTM-CHO细胞基因组中的1个单拷贝位点上,以潮霉素B筛选定点整合t-PA cDNA的细胞克隆.经筛选和体外纤维蛋白溶解活性检测,获得了t-PA表达水平为1 500～2 000IU/(106cells·day)的CHO工程细胞株.
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体细胞核移植技术进展
转基因动物的研究和生产是动物胚胎工程中诱人和有发展前景的课题之一.早期用受精卵原核内注射外源基因和利用精子作为载体将外源基因导入受精卵的方法,其缺点是整合效率低,而且很难实现定点整合,出生的转基因动物外源性基因的表达也不稳定[1].著名的多丽羊的诞生使体细胞核移植技术成为一种新的生产转基因动物的方法.
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腺病毒/重组腺相关病毒杂合体病毒的构建
目的:探讨解决RNA干扰(RNAi)抗HBV作用时间短暂的问题.方法:构建腺病毒/重组腺相关病毒(Ad/rAAv)杂合体病毒,恢复rAAv的定点整合,并借助定点整合的rAAV持续表达shRNA(shon hepairRNA),实现RNAi抗HBV的持久性.结果:经酶切和测序鉴定,各目的基因片段均成功克隆入穿梭质粒中pAd/rAAv酶切鉴定表明同源重组成功,病毒包装与滴度测定结果表明,Ad/rAAV杂合体痛毒包装成功.结论:利用Ad、AAV和HBV各种元件的特点,彼此互补,克服其不足,构建Ad/rAAV杂合体病毒,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题作了一些技术上的探索.
关键词： RNA干扰 Ad/rAAV杂合体病毒 定点整合 -
锌指核酶技术的原理及应用
锌指核酶(zinc finger nucleases,ZFNs)是将锌指蛋白的DNA识别域和非特异性核酸内切酶FokⅠ人工连接而构成的一种核酶.1对ZFNs能在DNA上产生双链断裂(double-strand breaks,DSB),诱导细胞发生同源重组(homology recombination,HR)或非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ).近锌指核酶技术在基因功能的研究中受到重视.作者就ZFNs的作用原理、关键技术及其应用领域进行介绍.
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用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究
目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体.方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI-neo的MCS中,构建表达载体pCI-FRT-HBsAg.以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆.检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+.将表达质粒pA-FRT HFLF和pOG44以1:9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+.转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测.筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆.在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其后的表达量为5mg/L.对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Western blot和抗原结合活性的检测.结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L.结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础.
关键词： 定点整合 FRT CHO/dhfr-细胞 基孔肯亚病毒 嵌合抗体 -
HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体的构建及其稳定表达细胞株的建立
目的:构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-FdttBid真核表达载体,并运用Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达该细胞的CHO工程细胞株.方法:应用PCR技术以pcMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆入pcDNA5/FRT载体中；通过Flp-InTM定点整合表达系统将e23sFv-Fdt-tBid整合入Flp-lnTM CHO细胞的基因组中一个单拷贝位点上,以适当的潮霉素B筛选定点整合e23sFv-Fdt-tBid cDNA的细胞克隆；通过基因组PCR技术和Westemblot技术检测e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达.结果:成功构建了pcDNA5/FRT-e23 sFv-Fdt-tBid表达载体；成功通过Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达e23sFv-Fdt-tBid蛋白的CHO工程细胞株；成功通过基因组PCR技术及基因组PCR技术和Western blot技术检测了e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达.结论:成功地构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体并建立了稳定表达该蛋白的CHO工程细胞株,为该蛋白的应用研究奠定了重要基础.
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突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略
腺相关病毒(Adeno-Associated Virus)为非致病性单链DNA微小病毒,野生型病毒仅仅在腺病毒等辅助病毒存在的情况下才会感染人体,对人体组织,特别是肝、脾等有很强的亲嗜性,可感染分裂和非分裂细胞,并定点整合到19号染色体.重组腺相关病毒(rAAV)载体虽然丧失了定点整合的特性,但是腺相关病毒转导的以附着体(Episome)形式存在的目的基因仍可在细胞内长期持续稳定表达.由于腺相关病毒有以上一些优点,因此被广泛应用于基因治疗的研究中,并且在某些遗传性疾病如血友病B临床试验中已经取得了非常好的效果.
