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一种新的干扰素基因刺激因子剪接异构体STING(sv)的结构和功能
干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)是病毒感染后机体抗病毒固有免疫反应过程中的重要蛋白分子.为了寻找STING新的剪接异构体,我们抽提了人类胚胎肾(Human embryonic kidney,HEK)293细胞RNA,用全长STING的mRNA(NM-198282.82)序列设计引物,作cDNA末端快速放大(RACE)及RT-PCR,生物信息学方法比较新序列,亚克隆STING野生型(wt)及STING剪接异构体(sv)至真核表达载体pEGFP-C1和pcDNA 3.1中.质粒EGFP-STING(wt)和EGFP-STING(sv)转染HEK 293细胞,用抗EGFP抗体作Western blot分析;质粒pcDNA-STING(wt)和pcDNA-STING(sv)转染HEK 293细胞,作荧光素酶功能分析以检测新剪接异构体对病毒诱导的干扰素β启动子荧光素酶活性的影响.我们发现了STING 3'端新的剪接异构体,与野生型相比,它缺失了第7外显子,导致阅读框架移位,相应蛋白质的C端30个氨基酸不同于野生型.Western blot出现相对分子质量(Mr)为58×103的STING(sv)蛋白强阳性条带.STING(sv)荧光素酶功能分析显示,该剪接异构体能明显抑制病毒诱导的干扰素β启动子活性.STING(sv)在多数组织和不同细胞系中都能表达.STING(sv)的发现为STING这一重要分子的功能调节提供了新的线索,它可能是病毒感染通路中干扰素的显性负性抑制剂,提示其为干扰素产生的精细调节成分,在人类病毒感染性疾病中的病理意义值得探究.
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COX-3:对乙酰氨基酚的作用靶点?
COX-3是环氧合酶的一种新型剪接异构体,与COX-1源于同一基因.不同物种如犬、鼠、人类,COX-3基因序列不同,编码的氨基酸序列也不同,COX-3蛋白的功能可能不同.COX-3对对乙酰氨基酚的抑制作用非常敏感,被认为是对乙酰氨基酚的作用靶点.COX-3的发现可能成为解开对乙酰氨基酚解热止痛作用机制的一把钥匙.
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比格犬雌激素受体β四个剪接异构体的发现
目的：在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上筛查雌激素受体β的剪接异构体。方法针对ERβmRNA CDS序列的八个外显子，两两外显子依次组合设计引物，运用PCR法，以比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织cDNA为模板扩增相应序列，测序后在NCBI网站比对，确定是目的基因后，用DNAMAN软件比对分析及手工校对，获得ERβ的剪接异构体。结果获得到了比格犬ERβ的四个剪接异构体，分别是第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体（缺失300 bp），部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体（各缺失334 bp，265 bp），以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体（缺失181 bp）。第4外显子完整缺失的剪接异构体和第7外显子完整缺失的剪接异构体获得了全长编码序列，另两个剪接异构体为部分编码序列。结论研究获得了比格犬ERβ的四个剪接异构体，为后续研究其在比格犬生殖调控中的作用机制打下了基础。
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猪FcγRⅡB多种剪接异构体的基因克隆与序列分析
目的:研究猪FcγRⅡB受体基因选择性剪接的多样性.方法:根据GenBank中猪FcγRⅡB (swFcγRⅡB)cDNA基因序列(DQ026064),应用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,应用RT-PCR技术,从不同个体的猪肺泡巨噬细胞中扩增FcγRⅡB基因并进行测序分析,在GenBank中查找猪FcγRⅡB DNA序列(NW-001886241.1),并用相关软件分析其外显子组成.结果:共克隆出6个转录体,其中转录体2,4在信号肽部分都有一个丙氨酸的缺失.转录体5,6是两个新型的FcγRⅡB 转录体,转录体5胞外区只有一个Ig结构域,转录体6是一个只含有一个Ig结构域的推导性可溶性Fc受体.结论:猪FcγRⅡB的表达因RNA选择性剪接方式不同而呈现出多样性.
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FoxM1与癌发生的相关剪接机制的探讨
FoxM1是一种原癌基因.它也是癌发生、发展密切相关的重要的转录因子.FoxM1是Forkhead Box转录因子家族重要成员,定位于染色体12p13.3,特异性表达于增殖期细胞中,在细胞终末分化时消失,是一个典型的与细胞增殖相关的转录因子,在细胞G/S及G/M期转换过程中发挥重要作用.它具有FoxM1A、B和C三种剪接异构体.FoxM1B和C在癌组织中高表达,发挥转录激活、促癌发生和发展的作用,而FoxM1A在癌组织中低表达,发挥转录抑制功能.癌组织中FoxM 1B/C的优先选择对于FoxM1发挥促癌作用非常关键.因此对这一现象的成因即FoxM1癌相关选择性剪接机制的研究非常重要.
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腺相关病毒新血清型的研究及其在肝病中的应用
腺相关病毒(AAV)是一种单链DNA依赖性病毒,属细小病毒科.AAV基因组有两个开放性读码区Rep和Cap,Rep包含P5启动子和P19启动子.P5启动子有两种RNA转录产物,编码生成Rep78蛋白和它的剪接异构体Rep68蛋白,在病毒复制、基因表达调控及宿主染色体定点整合中起重要作用.
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NR4A2基因及其选择性剪接异构体与胃癌发生及转移的关系
目的:检测胃癌中NR4A2(又称Nurr1)基因的表达,从NR4A2调控机制出发寻找相关选择性剪接异构体,探讨其与胃癌发生和转移的关系.方法:通过选择性剪接数据库(ASD)预测NR4A2基因可能存在的选择性剪接异构体,半定量PCR检测NR4A2及异构体的表达,基因测序技术鉴定新的剪接异构体;实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及剪接异构体的表达水平;免疫组织化学方法检测28例样本中NR4A2蛋白表达.结果:NR4A2基因在胃癌原位、癌旁、转移组织中均有表达,确定了2种剪接异构体NR4A2-Ⅰ和NR4A2-Ⅱ.实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及2种异构体在癌旁组织表达水平高于原位癌(P=0.017,P=0.007,P=0.004);在肝转移灶中表达水平低于原位癌(P=0.001,P=0.018,P=0.016),差异有统计学意义.免疫组化检测发现癌旁组织中NR4A2表达阳性率高于原位癌及转移灶,但差异无统计学意义(P=0.672).结论:胃癌原位、癌旁和转移组织中至少存在NR4A2基因的2种剪接模式;NR4A2及异构体的表达变化与胃癌发生和转移相关.
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肾透明细胞癌转移相关的CD99选择性剪接异构体的筛选
目的:寻找人肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中CD99转移相关选择性剪接异构体,探讨CD99选择性剪接异构体表达与ccRCC转移的关系.方法:通过选择性剪接数据库(alternative splicing database,ASD)对CD99基因可能存在的选择性剪接异构体进行预测.运用自行设计的5对特异性引物,采用RT-PCR技术,在转移组织、发生及未发生转移的癌组织、癌旁组织的各混合样本中检测6种预测异构体的表达,再对电泳所获条带进行克隆、测序.在各个组织样本中检测CD99Ⅰ、 CD99Ⅱ和新型CD99选择性剪接异构体(CD99-Ⅲ)的表达.结果:从6种预测异构体中筛选出一种新型异构体(CD99-Ⅲ).该异构体在转移组织中表达率(8/9) 高于未发生转移的原发癌组织(10/21,P<0.05).CD99Ⅰ型在样本中均表达,CD99Ⅱ型在发生转移的原位癌组织中表达率(6/9)远高于未转移的原发癌组织(3/21,P=0.008).结论:CD99-Ⅲ为一种新型选择性剪接异构体,且CD99Ⅱ型、CD99-Ⅲ的表达可能与ccRCC的转移进展有关.
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剪接因子对雌激素受体α7号外显子选择性剪接调控作用的研究
目的 通过上调或下调肿瘤细胞内hnRNP G、hnRNP I、hTra2-beta1的表达,探索细胞内三种剪接因子对内源性ERa△7形成的作用.方法 Real-Time PCR和Western blot筛选ERα阳性表达细胞株,对细胞株转染hnRNP G、hnRNP I、hTra2-beta1表达质粒和shRNA干扰质粒以上调或下调三种剪接因子的表达,Real-time PCR检测ERa△7和ERα exon7的表达量.结果 筛选出MCF-7为ERα阳性表达细胞株.在hnRNP G表达上调组中,ERα△7和ERα exon7的相对表达量与上调空载体对照组存在统计学差异(P＜0.05,P＜0.05),在hnRNP G表达下调组中,ERα△7和ERα exon7的相对表达量与下调空载体对照组显著差异(P＜0.05,P＜0.05);在hnRNP I表达上调组中,ERα exon7的相对表达量与上调空载体对照纽显著差异(P＜0.05);在hTra2-beta1表达上调组中,ERα△7和ERα exon7的相对表达量与上调空载体对照组显著差异(P＜0.05,P＜0.05),在hTra2-beta1表达下调组中,ERα△7和ERα exon7的相对表达量与下调空载体对照组显著差异(P＜0.05,P＜0.05),其中hnRNP G和hTra2-beta1对ERα7号外显子的作用为相反趋势.结论 hnRNP G和hTra2-beta1这两种蛋白可能在ERα exon7的选择性剪接方面存在相互拮抗的作用,hnRNP I对于ERα exon7的纳入存在拮抗作用,据此推测hnRNP G和hnRNP I在ERαexon7的选择性剪接存在协同作用.
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CD2相关蛋白剪接异构体启动子区及其缺失体的构建和活性分析
目的:构建CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)剪接异构体启动子区及其缺失体,转染HEK293及HeLa细胞,评价其启动子活性.方法:取稳定生长的HeLa细胞,常规方法提取总RNA,逆转录为cDNA并以此为模板,PCR扩增CD2AP剪接异构体之一CD2AP002转录起始位点上游2 200 bp的启动子区域片段,亚克隆这些片段至pGL-3基本载体上的多个克隆位点,构建含CD2AP002启动子的重组质粒.CD2AP002质粒构建成功后,以此质粒为模板重复上述步骤构建一系列CD2AP002启动子5’侧翼区缺失体.重组质粒及其缺失体转染人胚肾HEK293细胞及人宫颈癌HeLa细胞,双荧光素酶报告基因检测各片段的活性.结果:酶切、核酸序列分析证实,成功构建含CD2AP002启动子的重组质粒及其缺失体.经双荧光素酶活性检测证实不同片段大小的5’侧翼区序列缺失体均具有与片段长度相应的活性.结论:成功构建出在HEK293及HeLa细胞中具有活性的重组质粒及其缺失体.
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T 细胞因子4在肿瘤发生发展中作用的研究进展
随着人们在分子遗传学和细胞生物学方面对肿瘤发生研究的深入，发现调控正常细胞生长、分化、凋亡等生命活动的信号通路发生异常是肿瘤发生的必要条件。近年来 Wnt 通路逐渐受到关注，它不仅在人体胚胎器官发育中发挥重要作用［1］，而且其过度激活参与人体多种肿瘤的发生。T 细胞因子4（TCF-4）是 Wnt 通路核内信号传导的主要蛋白之一，大量的基因和生化研究已经证明其所在的家族是 Wnt 信号通路下游基因的初始特异性转录因子，因而被称为 Wnt 信号通路的开关［2］。本文就 T 细胞因子4的结构功能及其剪接异构体参与人体肿瘤的发生发展进行综述。
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反义寡核苷酸处理伊马替尼耐药慢粒细胞后Bcl-x剪接异构体的变化
目的 探讨反义寡核苷酸Vivo-Morpholinos(vMO)处理对伊马替尼(Imatinib,IM)耐药慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞中Bcl-x基因选择性剪接的影响.方法 将IM(1μM)组、荧光标记的vMO、IM联合vMO组(IM+vMO)、 空白对照组分别与IM耐药CML细胞株K562/G01细胞进行共培养48h,通过RT-PCR和Western Blot分别检测K562/G01细胞胞内Bcl-x剪接异构体Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值变化.结果 分别与IM组和vMO组处理K562/G01细胞相比,IM+vMO组的Bcl-xL mRNA和蛋白表达量显著降低,同时Bcl-xS mRNA和蛋白表达量明显升高,而对照组中Bcl-x剪接异构体变化不明显.结论 K562/G01细胞在vMO处理后Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值显著下调.
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人结肠癌组织环加氧酶-2 mRNA剪接异构体片段分离与克隆
目的探讨人结肠癌组织中是否存在环加氧酶-2(COX-2)选择性剪接异构体的表达及其可能意义.方法针对人COX-2 DNA第7、8外显子序列,设计一对全新引物,并采用RT-PCR技术,从结肠癌组织中分离COX-2mRNA,然后对电泳条带进行克隆、测序和分析.结果正常结肠组织和结肠癌组织均发现COX-2目的条带(252bp),但结肠癌组织则出现了一条新的电泳带(534 bp),经克隆和测序证实,该条带除目的条带的COX-2 DNA的第7、8外显子序列外,还包含第7、8外显子间的内含子序列,即保留的内含子(282 bp).根据阅读框推测,在保留的内含子第48～50碱基出现终止密码.结论首次发现结肠癌组织中存在COX-2基因的选择性剪接异构体(Genbankaccession number:BU493602,AY1512980),其所编码蛋白可能较已报道的COX-2酶蛋白小,且蛋白质的C末端缺少阿斯匹林作用位点.
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T细胞因子-4及其剪接异构体与肿瘤
T细胞因子(TCF-4)是Wnt信号转导通路中的核内信号分子,胞质区的β-连接素入核与之结合,可激活Wnt转导通路靶基因的转录,影响一系列基因的表达,在多种胚胎的发育及肿瘤演进的过程中,起重要的作用.TCF-4在转录过程中发生选择性剪接,形成多种mRNA剪接异构体,其剪接主要发生在羧基末端,形成长短不等的开放阅读框架,进而对下游基因产生多种转录调节机制,并对Wnt信号在各系统肿瘤中的作用进行调控.TCF-4及其剪接异构体的过度表达和异常调控与肿瘤的发生发展密切相关.
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大鼠巨噬细胞环加氧酶-2剪接异构体mRNA片段的分离和鉴定
目的:分离和鉴定大鼠巨噬细胞环加氧酶-2剪接异构体mRNA片段,并分析其可能意义.方法:采用RT-PCR和测序分析从大鼠巨噬细胞扩增、分离环加氧酶-2剪接异构体cDNA片段,并推导环加氧酶-2剪接异构体氨基酸序列,利用生物信息软件对氨基酸序列进行分析.结果:大鼠肺和血管平滑肌组织及腹腔巨噬细胞均发现COX-2目的条带(253bp),但腹腔巨噬细胞则出现了一条新的电泳带(422bp),经克隆和测序证实,该条带除目的条带的COX-2 DNA的第7、8外显子序列外,还包含第7、8外显子间的内含子序列,即保留的内含子(169bp).根据阅读框推测,在保留的内含子第21-23碱基出现终止密码.结论:首次发现大鼠腹腔巨噬细胞中存在COX-2基因的选择性剪接异构体(Genbank accession number:BU500100),其生物学意义有待进一步研究.
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VEGF-A基因及其选择性剪接与大肠癌研究进展
血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件，肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它提供氧气和营养物质。研究显示，这一过程中有多种因素和基因参与调控。目前发现与肿瘤血管生成和成熟有关的因子多达30余种。其中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体能特异地促进细胞分裂、增殖及迁移，在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。 VEGF 家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 以及胎盘生长因子等。其中， VEGF-A 是目前认为重要也是研究多的因子。根据外显子选择性剪接方式不同，VEGF-A 可以产生具有促血管生成作用的 VEGFxxx 亚型和具有抑制血管生成的 VEGFxxxb 亚型，本文就VEGF-A 及其剪接异构体与大肠癌的相关研究进展作一综述。
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TCF4N剪接异构体在食管癌细胞中的表达研究
目的 证实食管癌中TCF4N剪接异构体的存在,并初步探讨其功能.方法 采用RT-PCR方法扩增,并PCR产物测序鉴定.克隆TCF4N剪接异构体并构建真核表达载体,将其转染EC109细胞高效表达,检测其对细胞生物学特性的影响.结果 在癌细胞株中,TCF4N剪接异构体被证实存在.对比食管癌组织与癌旁组织发现TCF4N异构体在癌组织中表达显著降低(P＜0.05).成功构建了TCF4N表达载体,在EC109细胞中获得高效表达.功能分析显示:增强TCF4N表达可抑制EC109细胞的增殖,影响细胞周期的分布,并抑制TCF4的转录活性.结论 在人食管癌中具有抑制功能的TCF4N剪接异构体与食管癌的发生有一定关联.
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1个新的白介素-32剪接异构体的克隆与表达
目的 对白介素-32 (interleukin-32,IL-32)的不同剪接异构体进行克隆及表达.方法 设计保守引物,以Jurkat细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,克隆IL-32不同剪接异构体;DNA测序扩增产物,计算机辅助分析IL-32基因序列特征；构建IL-32原核及真核表达重组质粒,并利用SDS-PAGE和Western blot检测其表达情况.结果 克隆得到已知的IL-32的6个剪接异构体(α、β、γ、δ、ε、ξ),还克隆得到1个新的IL-32剪接异构体,将其命名为IL-32η,Genbank登录号JN546102.IL-32η编码区长度为336 bp,编码的蛋白含111个氨基酸残基,其理论相对分子质量为12 560.IL-32η原核表达产物主要以可溶形式位于宿主菌的周质腔.亲和纯化了重组IL-32η,利用重组IL-32η制备了兔多克隆抗体,该抗体能够识别IL-32全部的7个剪接异构体.结论 克隆得到1个新的IL-32剪接异构体IL-32η,它的发现将为全面理解IL-32的功能提供新思路.
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IRAK家族中TIR信号通路的关键因子
IRAKs(Interleukin-1 receptor associated kinases,IRAKs)作为TIR信号通路的重要连接体,在调节机体的自身免疫中起着重要的枢纽作用.家族成员包括IRAK1、IRAK2、IRAKM和IRAK4,目前还鉴定出8个剪接异构体.其中IRAK1和IRAK4有激酶活性,通过与MyD88和TRAF-6连接成复合物启动TLRs/IL-1介导的信号途径;而IRAK2和IRAKM则无激酶活性,对通路起着负调节作用.本文从IRAK的分子特点、作用和机制、与其它因子间联系及相应剪接异构体作一综述.
关键词： 白介素1受体相关激酶 Toll/白介素-1受体 信号通路 剪接异构体 -
恒河猴XC趋化因子受体1(XCR1)基因的克隆和体外表达
目的 了解恒河猴XC趋化因子受体1(XCR1)基因特征,并在HEK293T细胞上表达.方法 采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆恒河猴XCR1基因、并与GenBank中其他物种XCR1的cDNA序列进行比对.构建真核表达载体3.1-XCR1并转染HEK293T细胞,采用流式细胞术、Western blot法和激光扫描共聚焦显微镜技术检测XCR1蛋白的表达.结果 恒河猴XCR1 cDNA序列全长1665bp,包含415 bp的5’非翻译区(5'UTR)、1003 bp的编码区和248 bp的3'UTR;恒河猴XCR1编码区氨基酸序列与人XCR1的相似性为96.8％,而且具有相似的结构特征:含有七次跨膜结构,酸性N端以及保守的G蛋白锚定功能性基序HRYLSVV.与基因组序列比对和跨外显子反转录PCR结果表明,在恒河猴多种组织中只存在缺失第二外显子的剪接变异体.恒河猴XCR1可在HEK293T细胞中表达Mr 40 000左右的分子、主要分布于细胞质和细胞膜上.结论 除mRNA剪接异构体以外,恒河猴XCR1分子与人高度相似,并且能在HEK293T细胞中有效表达.
关键词： 恒河猴 XC趋化因子受体1(XCR1) 剪接异构体 真核表达
