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人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究
为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究.首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1～61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1～61)融合蛋白.经Ni NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白.后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态.结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1～61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95％以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式.本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础.
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轮状病毒P[6]基因型毒株LL4260株的VP8*核心区蛋白的表达和纯化
目的 为研究P[6]基因型轮状病毒受体结合特性,利用原核表达纯化得到P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株的VP8*核心区蛋白.方法 将P[6]基因型毒株LL4 260株的质粒利用PCR扩增得到核心区基因片段,克隆到pET30a载体中构建重组质粒pET30a-LL4260VP8+ core,重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达,经亲和层析和分子筛层析纯化表达后得到目的蛋白.结果 P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株核心区pET30 a-LL4260VP8* core蛋白为可溶表达,经纯化及电泳鉴定,得到相对分子质量为22×103的目的蛋白.结论 本研究构建的P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株pET30 a-LL4260VP8* core重组质粒,表达纯化了相应核心区目的蛋白,为进一步分析蛋白的性能和结构提供基础.
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猪苓Ⅱ型核糖体失活蛋白A链基因的克隆以及原核表达
采用RT-PCR技术从中国野生猪苓菌核(Polyporus umbellatus)中克隆得到一个Ⅱ型核糖体失活蛋白(type Ⅱ ribosome inactivating protein,RIP)A链基因,该基因cDNA包含的完整开放阅读框为873 bp,编码的氨基酸为290个,分子质量为32.33 kDa,理论等电点为5.58.氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有RICIN 超家族蛋白的保守结构域.氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示,猪苓RIP与硬柄小皮伞(Marasmius oreades)亲缘关系近.实时荧光定量PCR分析表明,这个基因在不同的菌核部位都有表达,且在蜜环菌侵染的菌核部位表达显著上调,提示该基因可能参与了猪苓响应生物胁迫过程.此外,利用基因重组技术构建pET15b-PuRIP原核表达载体,获得了高质量的His-PuRIP融合蛋白,为多克隆抗体的制备提供材料基础,为研究基因功能奠定基础.
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白木香AsMYC2蛋白的原核表达与纯化
MYC2转录因子属于bHLH转录因子家族中重要的一员,它是植物茉莉酸(JA)信号途径中的核心调控元件之一,但在白木香中研究甚少.本实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得AsMYC2基因的编码区(CDS)全长,利用基因重组技术构建pGEX-4T-1-AsMYC2原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,将鉴定正确的克隆转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃下0.1 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4h,AsMYC2蛋白的表达量高,且主要为可溶性蛋白.利用谷胱甘肽亲和介质进行融合蛋白的纯化,后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白.结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-AsMYC2原核表达载体,诱导了GST-AsMYC2(谷胱甘肽巯基转移酶-AsMYC2)融合蛋白的表达并进行了蛋白的纯化.高质量的GST-AsMYC2融合蛋白的获得,为多克隆抗体的制各提供材料基础,为筛选其互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础.利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术对该基因进行组织表达特异性分析,结果显示AsMYC2基因在沉香形成的主要部位根和茎中的表达量高,在叶中的表达量低;该结果提示该基因可能与白木香中沉香的形成有关.
关键词： GST-AsMYC2 白木香 载体构建 蛋白表达与纯化 组织表达 -
肝细胞癌中TBC1D4表达及其诱导的血清抗体免疫应答
检测肝细胞癌患者肿瘤组织中TBC1D4的蛋白表达及其诱导的自身体液免疫应答,为肝细胞癌患者进行特异性免疫治疗提供部分依据.原核表达,镍鳌合亲和白纯化TBC1D4蛋白分子,免疫组化检测26例肝细胞癌患者癌组织的TBC1D4表达；ELISA方法测定96肝细胞癌患者与150例健康对照者血清中抗TBC1D4蛋白抗体的水平.表达纯化了重组蛋白TBC1D4,并诱导出多克隆抗体.26例癌组织中,9例(34.6％,9/26) TBC1D4蛋白表达水平增高；96例患者血清中,17例(17.7％,17/96)血清抗TBC1D4蛋白抗体阳性,150例健康对照者血清全部为阴性.患者组抗体阳性率显著高于健康对照组(P＜0.01).结论认为,TBC1D4蛋白分子在肝细胞癌组织中表达增高,并具有免疫原性,可能是肝细胞癌免疫治疗的一个良好的靶抗原.
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人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化
目的:在大肠杆菌中表达人源转录因子sp1蛋白,并进行体外纯化.方法:首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1 (88-786aa),通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白.结果:融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白.结论:本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础.
