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HPV-2 E2蛋白(A338V)突变体对E2蛋白DNA结合能力增强的研究
HPV-2是引起皮肤寻常疣的常见HPV型别,病毒E2蛋白可抑制病毒早期启动子的活性.我们曾经报道来自一例巨大寻常疣患者的HPV-2突变E2蛋白对病毒早期启动子活性的抑制作用明显减弱,该E2蛋白在其C末端的DNA结合区域带有A338V的点突变.本研究利用原核表达系统表达纯化了突变E2(A338V)和HPV-2原毒株的羧基端和全长蛋白.电泳迁移率实验结果显示,E2蛋白可与带有E2蛋白特异性结合位点的寡核苷酸探针形成复合物,突变E2蛋白比原毒株E2蛋白的DNA结合能力强.这提示DNA结合能力的增强可能为E2蛋白对病毒启动子活性影响的分子基础,与患者出现罕见巨大寻常疣这一临床表型关联.
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高危型人乳头瘤病毒E2蛋白功能研究进展
高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是诱发宫颈癌,肛门癌,外阴癌及部分头颈癌等多种肿瘤的主要原因.在病毒生命周期过程中,HPV E2蛋白通过与病毒自身及宿主基因组DNA及蛋白相作用,在病毒基因转录调控、病毒DNA的复制和维持中起到关键作用,其还对宿主细胞转录、RNA加工、凋亡、泛素化及胞内转运等多种活动产生影响,为病毒增殖创造有利的宿主细胞环境,并在HPV致病过程中发挥重要作用.为了解E2蛋白的各种功能及其与病毒和宿主DNA和蛋白作用情况、HPV病毒生活史、HPV病毒致病和致癌机制的研究均有着重要的意义.细致描述E2蛋白的功能可以帮助我们寻找病毒相关疾病治疗的新方法.本文以HPV16为重点,对高危型HPV E2蛋白结构、功能和活性相关研究的进展进行了综述.
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HPV16 E2蛋白及其TAD和DBD对巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响
目的 分析人乳头瘤病毒(HPV) 16型E2蛋白及其转活性结构域(TAD)和DNA结合结构域(DBD)与绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)中的定位,并研究其对MΦ分泌TNF-α和IL-1β的影响.方法 将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD分别转染MΦ,倒置荧光显微镜下观察融合蛋白在MΦ中的分布与定位,通过ELISA测定转染细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的含量.结果 GFP、GFP-E2融合蛋白在MΦ细胞核、细胞浆内均有表达,且后者细胞核荧光亮度强于细胞浆；GFP-DBD融合蛋白表达于细胞核,GFP-TAD表达于细胞浆.GFP-E2组细胞培养上清中TNF-α和IL-1β含量分别为(321.83±22.00)pg/ml和(214.35±22.79)pg/ml,GFP-TAD组分别为(371.79±22.73)pg/ml和(233.52±17.75)pg/ml,GFP组和空白组分别为(265.74±28.74) pg/ml、167.60±18.68)pg/ml和(234.76±31.94)pg/ml、155.13±20.541)pg/ml,差异有统计学意义(P＜0.05)；GFP-DBD组分别为(258.24±33.55)pg/ml和(148.08±19.50)pg/ml,与GFP组和空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).GFP-TAD组与GFP-E2组比较TNF-α含量差异有统计学意义(P＜0.05),IL-1β含量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 真核表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD均能在MΦ中表达相应的融合蛋白,GFP-E2主要定位细胞核,GFP-DBD仅定位细胞核,GFP-TAD仅定位细胞浆；HPV16 E2及其TAD即时高表达上调MΦ分泌TNF-α和IL-1β.
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人乳头瘤病毒E2蛋白生物学活性及疫苗研究进展
人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)能感染皮肤和粘膜的基底层上皮细胞,尤其与生殖系统感染相关密切.乳头瘤的形成与HPV E2蛋白密不可分,该蛋白质与细胞增殖及病毒的有丝分裂等有关.近年来,学者们利用E2蛋白的特性研制出各种E2蛋白相关的疫苗,有助于清除与HPV感染有关的早期病变,有效降低宫颈癌的发生.
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丙型肝炎患者血清中的交叉中和抗体
目的 分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体.方法 以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T 细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原,建立检测HCV E2抗体的ELISA方法,检测48份HCV抗体阳性的慢性丙型肝炎患者血清,然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应,再用5株HCV假病毒为模型分析阴性血清的病毒中和活性.结果 48份抗-HCV阳性血清中,E2抗体阳性血清达36份,阳性率75%.免疫荧光分析的结果与ELISA检测一致.HCV E2抗体阳性血清对5株HCV假病毒的感染性均有不同程度的中和作用,中和活性与E2抗体水平相一致.结论 丙型肝炎患者血清中存在交叉中和抗体,提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙型肝炎疫苗或许具有可行性.
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丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用
目的:在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)E2包膜蛋白,并对其进行初步纯化.用纯化的包膜蛋白检测HCV RNA阳性血清中E2抗体,研究其检测E2抗体的敏感性和特异性.方法:将HCV E2蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌.用IPTG诱导细菌表达E2蛋白,经离子交换层析纯化蛋白.用纯化的包膜蛋白包被微孔板,经ELISA方法检测HCV RNA阳性血清中的E2抗体.结果:在大肠杆菌表达了相对分子质量为45 000的可溶性E2蛋白,占细菌总蛋白量的21%,纯化后,蛋白纯度为85%.用其检测HCV患者血清171例,E2抗体的检出率为63%.在E2抗体阳性的血清中,部分为抗HCV阴性.结论:E2蛋白的表达及初步纯化的成功,可能用于临床检测.各基因型HCV E2包膜蛋白的抗体之间有交叉反应,在目前的抗HCV诊断试剂中加入可溶性、非融合E2包膜蛋白,可以改善抗HCV诊断试剂的特异性和敏感性.
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猪瘟病毒E2蛋白重复多表位基因的融合表达及其兔体免疫保护研究
目的:研究猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重复多抗原表位基因的融合表达及其免疫攻毒保护作用.方法:应用PCR方法扩增猪瘟病毒E2蛋白重复多抗原表位基因,构建重复多表位基因的原核重组表达质粒PGEX-3E,进行融合蛋白的表达和纯化.ELISA和Western blot方法测定单表位融合蛋白GST-E和多表位融合蛋白GST-3E与猪抗CSFV的阳性血清和兔抗E2阳性血清的反应性,并进行融合蛋白的兔体免疫及免疫攻毒保护的比较研究.结果:分子克隆和构建了原核重组表达质粒pGEX-3E,表达和纯化了融合蛋白GST-3E;单表位融合蛋白与重复多表位融合蛋白均能够与猪抗CSFV的阳性血清反应和兔抗E2的阳性血清产生免疫反应.在刺激兔体产生抗体方面,单表位融合蛋白刺激兔体产生抗体的能力较弱,而多表位融合蛋白则能够使兔体产生高效价的抗体.接种100 MID50剂量猪瘟兔化弱毒(HCLV)进行的兔体免疫攻毒保护试验表明,空白对照组和载体蛋白GST免疫组无保护作用,单表位融合蛋白免疫组具有一定的免疫保护作用,而重复多表位融合蛋白免疫组则完全能够抵抗猪瘟病毒的攻击.结论:猪瘟病毒E2蛋白重复多表位的融合表达具有免疫保护作用,本实验的成功完成为猪瘟病毒多表位抗原的串联及多表位疫苗的研究奠定了基础.
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大肠杆菌高效表达的HCVE2蛋白在丙型肝炎检测中应用
为探讨大肠杆菌高效表达的HCV E2蛋白在丙型肝炎诊断中应用价值,采用了238份HCVRNA阳性血清标本进行了E2抗体和抗HCV测定,方法采用ELA,和PCR法.结果有164份E2抗体阳性,占68.9%,卡方检验P＞0.05;用抗HCV检测与E2抗体测定方法比较,两种方法无显著性区别(P＞0.05);在HCV RNA阳性,抗HCV阴性的血清中,有半数可测出E2抗体的阳性.提示在大肠杆菌中高效表达了可溶性的HCV E2蛋白,纯化后可进行E2抗体测定,且E2抗体阳性数与HCVRNA,抗HCV阳性数无显著性差别,E2抗体可以检出一部分抗HCV检测不能检出的HCV感染者.
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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的可溶性表达
目的 可溶性表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白.方法 参考BVDV NADL株序列设计1对特异性引物,PCR扩增BVDV NADL株E2全长编码区片段,目的片段经限制性内切酶克隆入质粒pET28a,经双酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒转化E.coli Rosetta (DE3)宿主菌,37℃IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;表达的重组蛋白经Ni-NTA Purification System纯化后进行SDS-PAGE鉴定.结果 表达的重组E2蛋白相对分子质量约45 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的38.9％,可与BVDV阳性血清发生特异性反应,纯度达95％以上,浓度约3.8 mg/ml,产量可达4.96 mg/L细菌培养物.结论 实现了可溶性重组BVDV E2蛋白在原核表达系统中的表达,并具有较好的生物学活性.
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牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化
目的 在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化.方法 采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析.结果 重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20％,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95％,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应.结论 在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础.
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猪瘟病毒E2蛋白基因重组人5型腺病毒的构建及鉴定
目的 构建猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV )E2蛋白基因重组人5型腺病毒,并进行鉴定.方法 通过巢式PCR从猪瘟活疫苗中扩增CSFV E2全基因序列,克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA的多克隆位点处,构建重组穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA-E2,将其线性化后与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,进行重组腺病毒的包装.细胞完全病变后,采用RT-PCR法检测E2基因mRNA的转录;细胞病变法检测病毒滴度;连续传代后检测病毒的稳定性;Western blot法检测E2蛋白的表达;以105.82 TCID50重组腺病毒经腹腔免疫小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清猪瘟抗体效价.结果 重组穿梭质粒paeAd5 CMVK-NpA-E2经双酶切及测序证明构建正确;重组腺病毒rAd5v-MxE2转染的293AD细胞可检测到E2基因的转录和蛋白的表达;重组腺病毒的滴度为105.82 TCID50/ml;第5、30代重组腺病毒均可扩增出目的基因条带,病毒滴度无明显变化;重组腺病毒免疫小鼠后,可产生CSFV抗体.结论 成功构建了CSFV E2基因重组人5型腺病毒,其免疫原性良好,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础.
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东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性
目的 表达、纯化东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus,EEEV)E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性.方法 利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析.将BALB/c小鼠随机分为4组∶PBS对照组、弗氏佐剂对照组(弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化)、E2蛋白组(E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合)和E2蛋白+弗氏佐剂组(E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化),每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100 μl/只.第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4+和 CD8+T细胞比例；第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量；第3次免疫后第7天,采用MrT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况；每次免疫后第14天,采用EHSA法检测小鼠血清中IgG抗体效价.结果 表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3％；纯化的重组E2蛋白纯度达95％以上；表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合.与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白+弗氏佐剂组小鼠体内CD4+与CD8+T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高(P＜0.01)；小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320.结论 表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考.
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丙型肝炎疫苗研究现状与方向
丙型肝炎(丙肝)病毒(hepatitis C virus,HCV)主要经血液传播,是急性和慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子.目前全球HCV感染者约有1.7亿,每年新增感染者达300万～400万,我国HCV感染者近4 000万.HCV感染的慢性率高达70%以上,至今尚无有确切保护作用的疫苗问世,迫切需要发展有效的疫苗预防、控制HCV的感染和传播.
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庚型肝炎病毒E2蛋白在转基因小鼠细胞内的定位及致病性研究
目的:在已建成庚型肝炎病毒(HGV)转基因小鼠模型的基础上,研究HGV包膜蛋白E2在转基因小鼠体内的表达及定位,并探讨HGV在转基因小鼠体内是否引起病理学改变.方法: 取小鼠的器官组织用免疫组织化学方法,以H GV E2蛋白的单克隆抗体对HGV包膜蛋白E2的表达进行分析和定位.通过血清ALT检测及常规病理学技术观察转基因小鼠不同器官的病理学变化.结果: 免疫组织化学结果表明,HGV E2主要表达于转基因小鼠肝细胞膜,少量表达于胞质内;肾脏、心脏、肺及脾脏均未呈现E2蛋白的阳性反应.组织病理学检查显示转基因小鼠的肝细胞出现水样变性、脂肪变性及淋巴细胞浸润等轻度炎性反应,这些变化不随年龄增长而加重;其他组织的病理学检查无异常.转基因小鼠血清转氨酶ALT与对照小鼠无明显差异.结论:HGV包膜蛋白E2的表达具有相对的嗜肝性,主要分布在转基因小鼠的肝细胞膜,并可引起轻度肝细胞损伤.
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从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位
目的:筛选能识别庚型肝炎病毒 (HGV)E2区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽.方法:利用抗HG V E2区的3株单克隆抗体M6,M13,M30作为筛选配基,对构象限制性的随机环9肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定.结果:证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出16个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有14个克隆与M6抗体有较强的特异结合;其中10个克隆在竞争抑制实验中抑制率大于50%.DNA测序表明9个克隆具有氨基酸核心序列GYAPLS,该序列与HGV E2区第306～311位氨基酸有较好的同源性.用合成肽与核心序列相似的噬菌体克隆P9GC5和P9GC11进行HGV E2抗原抗体实验,显示它们的IC5 0分别为4.5和7.2 nmol/L.结论:从噬菌体随机肽库中筛选到能与H GV E2抗体特异性结合的HGV抗原表位,并确定与合成了具有活性的核心多肽序列.
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人乳头状瘤病毒E2蛋白相关疫苗的研究进展
人乳头状瘤病毒(HPV)感染与生殖器疣、生殖器肿瘤的发生有关, 95%以上的宫颈癌伴有HPV感染.HPV基因组分为长控区(LCR)、早期区(E区)和晚期区(L区),其中E区基因分别编码早期蛋白质E1、E2、E4、E5、E6和E7.目前的HPV治疗性疫苗主要是针对E6、E7的重组基因疫苗.
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风疹病毒糖蛋白2-核蛋白优势抗原表位原核可溶性融合表达与血清学诊断研究
目的 利用原核系统对风疹病毒E2-C(糖蛋白2-核蛋白)融合蛋白优势抗原表位肽段进行表达和纯化,开发用于临床检测风疹病毒特异性抗体的抗原.方法 通过生物信息学预测E2-C优势抗原表位,根据原核系统表达特点进行序列优化,全基因合成获得风疹病毒E2-C优势片段核酸序列,构建pET-DsbC(二硫键异构酶)-E2-C融合表达载体,在原核系统内进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的抗原性.结果 纯化获得的融合蛋白DsbC-E2-C经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测80份临床阳性血清和60份健康人血清.其中以酶标记DsbC-E2-C蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达75％(60/80),阴性检出率为100％,初步验证DsbC-E2-C优势抗原表位融合蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论 获得融合蛋白DsbC-E2-C在大肠杆菌中高表达,高纯度重组蛋白抗原性和特异性比较强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可开发试剂盒用于检测风疹病毒的早期感染.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因
目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV E2蛋白反式调节相关基因.方法以HCV E2表达质粒pcDNA3.1(-)-E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HCV E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1 000 bp插入片段.挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因.通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中.结论应用SSH技术成功构建了HCV E2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HCV E2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据.
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风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2重组体的构建表达与抗原性分析
风疹病毒(Rubella virus, RV)是人类重要、常见的致畸病毒之一,但其致畸机理至今尚未完全明了[1].RV的包膜上镶嵌着两个糖蛋白E2和E1,E2/E1以异二聚体的形式在病毒体表面形成刺突结构[2].E2的糖基化程度很高,存在O-联及N-联糖基化位点,糖类在成熟的E2蛋白中所占比重大于三分之一,E2蛋白的糖基化程度影响蛋白功能,糖基化位点的改变可能与RV减毒有关[3].
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人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达
目的 将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18, HPV18) E2基因插入到原核表达载体pET28a(+)T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础.方法 1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2;2) PCR、限制性内切酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a(+)-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达.结果 1) PCR、限制性内切酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2的成功构建;2) SDS-PAGE电泳分析, HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符.结论 1)成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白.
