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中国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gei/07-30磷蛋白基因的分子特征及其编码蛋白特性分析
对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行磷蛋白基因序列测定,并进行分子生物学特征分析.首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出病毒磷蛋白基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析.小反刍兽疫病毒china/Tib/Gej/07-30磷蛋白基因由1 655个核苷酸组成,编码2个相互交叠的开放阅读框(0RF).第一个ORF长度为1530个核苷酸.编码的P蛋白长度为509个氨基酸.第二个ORF长度为534个核苷酸,编码的C蛋白长度为177个氨基酸.第一个ORF通过基因编辑在751位插入1个G核苷酸,转录生成第二个mRNA,长度为897个核苷酸,编码的V蛋白长度为298个氨基酸.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的P蛋白与其他分离株氨基酸序列同源性为86.1%～97.3%,C蛋白氨基酸序列相似性为84.3%～94.9%,V蛋白为82.9%～96.3%.China/Tm/Gej/07-30的P蛋白第315～387位氨基酸是一段高度保守的七肽重复序列.
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猕猴B病毒gC蛋白特异性抗原表位的合成和表达
目的 获得B病毒gC蛋白的特异性表位抗原.方法 利用长片段基因合成的方法,合成B病毒C蛋白的特性抗原表位基因,将该基因连接到pMAL-5x载体,转化到BL21受体菌进行表达,并纯化表达产物.结果 成功的获得了B病毒gC蛋白的特异性抗原蛋白,该蛋白以可溶的形式表达.结论 利用原核表达系统,可以产生B病毒gC蛋白的可溶性抗原,可以作为B病毒的检测抗原.
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寨卡病毒亚洲型与非洲型基因同源性及重组分析
目的 分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)亚洲型与非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、前膜蛋白(pre-membrane,prM)核苷酸和氨基酸序列差异,并探讨了ZIKV亚洲型和非洲型位点突变可能产生的后果.方法 在GenBank中登录的ZIKV亚洲型和非洲型序列中,分别选择5个不同的全长基因组序列,并获得其相应的氨基酸序列,采用BIOEDIT软件进行比对,分析相似度,统计不同型别间结构蛋白C、prM的核苷酸突变和氨基酸替代位点,并采用SimPlot软件分析两个型别间的同源重组.结果 ZIKV亚洲型与非洲型的核苷酸相似性在88.00％ ～ 89.00％之间;不同型别的结构蛋白C和prM碱基的突变比较显示,C基因共有19个碱基突变,prM基因共有48个碱基突变;氨基酸翻译比对显示,这67个碱基突变均为有效突变.两个型别结构蛋白C和prM编码的289个氨基酸中,占组成比例多的均为亮氨酸(L),同源重组分析亚洲型与非洲型一致性较高,无重组信号.结论 通过对ZIKV亚洲型与非洲型的结构蛋白C、prM核苷酸序列、氨基酸的比较分析及同源重组分析,为研究ZIKV不同基因型间的生物学和致病性差异提供参考.
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活化C蛋白
活化C蛋白是由C蛋白在凝血酶-血栓调节蛋白复合物的作用下转化而来,是一个重要的生理抗凝剂.它通过灭活凝血因子Ⅴa和Ⅷ a而对凝血系统进行调控,同时它还有抗炎、调控细胞凋亡和内皮细胞存活的功能.近,用于治疗严重败血症的重组人活化C蛋白制品已成功开发,同时对其它相关产品的研制和开发也在进行之中.
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风疹病毒糖蛋白2-核蛋白优势抗原表位原核可溶性融合表达与血清学诊断研究
目的 利用原核系统对风疹病毒E2-C(糖蛋白2-核蛋白)融合蛋白优势抗原表位肽段进行表达和纯化,开发用于临床检测风疹病毒特异性抗体的抗原.方法 通过生物信息学预测E2-C优势抗原表位,根据原核系统表达特点进行序列优化,全基因合成获得风疹病毒E2-C优势片段核酸序列,构建pET-DsbC(二硫键异构酶)-E2-C融合表达载体,在原核系统内进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的抗原性.结果 纯化获得的融合蛋白DsbC-E2-C经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测80份临床阳性血清和60份健康人血清.其中以酶标记DsbC-E2-C蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达75％(60/80),阴性检出率为100％,初步验证DsbC-E2-C优势抗原表位融合蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论 获得融合蛋白DsbC-E2-C在大肠杆菌中高表达,高纯度重组蛋白抗原性和特异性比较强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可开发试剂盒用于检测风疹病毒的早期感染.
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外源HCV核心基因表达载体在HepG2中蛋白表达的亚细胞定位
目的 研究HCV全长(天然)核心蛋白(C蛋白)和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位,为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据.方法 设计HCV全长和成熟核心基因引物,以pBRTM/HCV1-3011为真核表达载体为模版行PCR;将PCR扩增产物酶切纯化后定向插入pEGFP-C1的BeglⅡ和EcoR Ⅰ位点,得到能表达全长HCV核心蛋白(C191 aa.)和成熟核心蛋白(C173 aa.)的真核表达载体pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173;将扩增pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173质粒转染到HepG2细胞中,28 h、5 d在荧光显微镜下观察两种C蛋白的亚细胞定位.5 d后再用免疫细胞化学法观察两种C蛋白在HepG2细胞中着色现象.结果 HCV核心基因PCR产物和构建的pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173经扩增测序证实.pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞28 h后融合荧光全长C蛋白C191主要出现在核膜和胞质中,少部分出现在胞核及其膜中;而pEGDP-C1-C173转染HepG2细胞28 h后主要定位在核中和核膜上.但pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞5 d后,其表达的融合荧光蛋白主要出现在核内和核膜上,少量在胞质中;而成熟C蛋白C173则仍然在胞核内及核膜上.pEGDP-C1-C转染HepG2细胞5 d后进行免疫细胞化学显示,C191蛋白和C173蛋白主要在核中、核膜着色,胞质有少量着色.结论 HCV全长C蛋白的亚细胞定位是一动态过程,先出现在胞质中和核膜上,后定位在核中和核膜上;成熟C蛋白主要定位在核中和核膜上.这种现象为解释瞬时转染HCV不同长度C基因对p53/p21通路作用出现相反结果奠定基础.
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HCC和HepG2细胞表达HCV C蛋白、p14ARF、p21WAF1的意义探讨
目的 检测HCV C蛋白、p14、p21在HCC和表达野生p53 HepG2中的表达,初步探讨C蛋白在HCC和HepG2中对p14-p53-p21凋亡通路的作用.方法 收集42例HCC石蜡组织,采用免疫组织化学EnVision法检测HCC组织中核心蛋白、p14和p21的表达,用统计学方法及临床联系分析它们之间的关系;用细胞化学EnVision法和免疫荧光法检测核心蛋白、p53、p14和p24在HepG2细胞中的表达.结果 C蛋白、p14和p21的阳性表达主要定位于细胞核膜和细胞核中;HCC组织中C蛋白、p14和p21阳性率分别为40.5%、45.24%、19.05%;3组间的Kruskal-Wallis检验P=0.03,差异显著;C蛋白与p14、p21间及p14与P21间蛋白阳性强度相关性分析显示,P值分别为0.000、0.43、-0.34,相关系数rs分别为0.64、-0.29、-0.33.HepG2细胞有较高的C蛋白和P53表达及少量的p14、p21蛋白表达.结论 在C蛋白阳性的HCC中p14的表达与C蛋白有关,HCC中p21表达缺陷是十分常见的;C蛋白在HCC中可能影响p53通路,下调p21的表达,阻止其凋亡作用;HepG2细胞永生化特性可能与HCV或HCV C蛋白有关.
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HCV-C蛋白抗原在人肝细胞株中的表达和鉴定
目的: 构建HCV-C蛋白基因的真核表达载体,并在正常人肝细胞HL-7702中表达与鉴定.方法: 从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM/HCV1-3011质粒中,扩增HCV core基因片段,构建pcDNA3.1(-)/core重组真核表达质粒.然后采用阳离子多聚体将其转染人正常肝细胞HL-7702,用免疫组化染色(SP)法检测HCV C蛋白的表达,并通过Western blot进行鉴定.结果: 所克隆的HCV-C基因片段的大小为573 bp,序列正确.成功地构建了pcDNA3.1(-)/core重组表达质粒.以其转染HL-7702细胞后,用SP免疫组化染色法检测到了C蛋白的表达.Western blot显示,其相对分子质量(Mr)约为21 000.结论: 构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/core在人肝细胞中能有效表达HCV-C蛋白,为以后相应抗体的制备打下了基础.
