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HCV核心蛋白影响细胞凋亡可能机制的研究进展
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)核心(core)蛋白能与细胞的多种蛋白结合,调节多种细胞基因的转录活性,影响宿主细胞凋亡和免疫系统的功能,还影响HCV感染细胞的增殖和分化等,在HCV感染的病理发生和慢性化以及宿主细胞的恶性转化等过程中起重要作用.文章主要综述了近年来关于HCV核心蛋白影响细胞凋亡可能机制的研究进展.
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痘苗病毒主要核心蛋白水解的研究进展
痘苗病毒(vaccinia virus,VV)是痘病毒科正痘病毒属的dsDNA病毒,具有独特的形态及宿主细胞质复制位点[1].其病毒颗粒有4个结构组分:核心、侧体、外膜和包膜(只存在细胞外包膜病毒中)[2].该病毒的基因组大约185 ～ 200kb,编码200多种不同的病毒蛋白[3].VV在复制晚期(即病毒DNA合成后)发生了一系列复杂反应,用以形成成熟的病毒粒子[4].
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丙型肝炎病毒核心蛋白引发肝脂肪变性机制的研究进展
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种主要经血液传播的肝炎病毒,是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要原因之一.已经证明,HCV感染引发的肝脏脂肪变性与慢性丙型肝炎患者的肝脏纤维化及对抗病毒治疗的疗效应答有显著的影响,因此HCV核心(Core,C)蛋白引发肝脏脂肪变性机制的研究对探索HCV感染治疗新方法,乃至终控制HCV感染,都有十分重要的意义.
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丙型病毒性肝炎病毒感染实验诊断技术及方法学概述
丙型病毒性肝炎(丙肝)病毒感染呈世界性传播,严重威胁人类健康.预防和控制丙肝传播的重要手段之一是临床早期明确诊断,及时抗病毒治疗.临床常用的实验诊断血清标志物主要有HCV-Ab、HCV-Ag,以及HCV-RNA定性/定量、HCV-基因型及基因亚型的检测.本文介绍了丙肝病毒感染的实验诊断技术及方法学(包括ELISA、RIBA、CHA、DIFA、real-time PCR和RT-LAMP)研究的现况,希望能够为丙肝的临床诊断、疾病监测及其流行病学调查有所裨益.
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猪瘟病毒核心蛋白研究进展
核心蛋白是猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的结构蛋白之一,除了构成病毒核衣壳保护内部的基因组RNA外,还参与转录调节,并可和多种宿主蛋白相互作用,在病毒感染过程中发挥重要作用.本文结合当前对CSFV核心蛋白的无序性,结构特点,功能特点,以及和病毒的非结构蛋白NS3、NS5B,宿主蛋白SUBMO-1、UBC9、OS9、IQGAP1相互作用的研究,综述了CSFV核心蛋白在猪瘟病毒致病力、毒力和基因组RNA复制中发挥的重要作用,以期为CSFV核心蛋白的进一步研究提供参考.
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鸭乙型肝炎病毒基因组结构及其编码蛋白的研究进展
鸭乙型肝炎病毒(DHBV)属于禽嗜肝病毒属、嗜肝DNA病毒科病毒,与人乙型肝炎病毒(HBV)具有相同的复制方式及相似的基因结构、抗原结构.DHBV基因组是闭合环状不完全双链DNA,3个主要ORF-PreS/S、ORF-PreC/C、ORF-P位于负链,编码L蛋白、S蛋白、C蛋白和P蛋白.本文通过对DHBV基因组结构特征及其编码病毒重要蛋白的基本特性、结构特点与功能进行全面阐释,旨在对DHBV的深入研究提供重要参考和以DHBV人工感染建立的动物模型研究HBV提供重要理论依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究
以杆状病毒-昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac为模型,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨.根据核心蛋白的亲水性分析结果,设计了三种长度的基因片段(C173、C191和C215),经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,获得三种重组病毒(rvBACC173、rvBACC191和rvBACC215)用于表达分析.SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验表明,昆虫细胞能够识别核心蛋白第191和192位氨基酸之间的切点并低效率切割;但不能够识别173～191位之间的切点.间接免疫荧光试验表明,截断型核心蛋白C173定位于细胞核内,而C191和C215则停留在细胞浆中.rvBACC173感染的细胞在核内出现单一的"类晶体样结构",电子显微镜分析证实,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体.试验结果还表明,第173至191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达,并且影响蛋白在细胞内的分布.间接ELISA实验证实,部分纯化的核心蛋白可用作诊断试剂检测人血清中的特异性抗体.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在患者外周血单个核细胞内的核表达检测
目的检测和研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白在患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)内核表达的意义,并探讨其与临床的关系.方法对66例慢性丙型肝炎患者PBMC标本进行免疫组化检测,并将HCV蛋白抗原定位分布情况与患者临床状况进行比较分析,对其中27例患者PBMC进行HCV RNA和HCV Ag的平行检测和分析.结果免疫组化结果显示,慢性丙型肝炎患者PBMC HCV Ag(core+NS3)阳性检出率为77.27%(51/66).结果还证实,HCV核心蛋白均定位于胞核内,且呈强表达;NS3蛋白主要定位于胞质内,呈弱表达.当进行HCV Ag在PBMC内定位情况与患者临床状况比较分析时显示,病情较重患者PBMC内核心蛋白表达阳性率(35.29%)明显高于病情较轻者(5.88%)(P<0.001).结论 HCV核心蛋白在PBMC内核表达与患者临床状况相关,提示其可能是丙型肝炎慢性化的一个指标,并可能在肝硬化和肝癌发生上起一定作用.
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土拨鼠肝炎病毒核心蛋白的高效表达和B细胞表位鉴定
目的 建立高效表达土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHcAg)的方法并对其B细胞表位进行鉴定.方法 分别构建不同截短型WHcAg的质粒以了解能大量表达并形成WHV核心颗粒的区段,利用变性WHcAg制备单克隆抗体以寻找能与WHcAg线性B细胞表位结合的单克隆抗体.结果 WHcAg前144或149氨基酸残基能够大量表达并能形成颗粒样结构.这2种截短型WHcAg能够在大肠杆菌中表达并组装成直径为34 nm的核心颗粒,终纯化获得毫克级的核心蛋白.截短型WHcAg保留了全长WHcAg的抗原性,而且变性WHcAg存在另外的B细胞线性表位,利用变性WHcAg进行免疫制备单克隆抗体获得的5株抗体均针对WHcAg的N末端表位,该表位在WHcAg和HBcAg高度保守.结论 建立了高效表达WHcAg的方法,制备了针对WHcAg单克隆抗体.并对WHcAg的线性B细胞表位进行了鉴定,发现WHcAg和HBcAg的N末端存在共同的线性B细胞表位.
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丙型肝炎病毒N′-核心蛋白RNA结合区的定位
目的对丙型肝炎病毒核心蛋白的RNA结合区进行详细定位,为制备缺失RNA结合活性突变体做准备. 方法构建GST融合丙型肝炎病毒核心蛋白不同区域片段表达质粒,在大肠杆菌中表达相应蛋白并用glutathione sepharose 4B进行纯化,利用二次电泳法检测RNA的结合活性,利用时相差电泳法比较不同区域RNA结合活性的强弱. 结果核心蛋白第1～132位氨基酸(AA)之间的片段得到了良好的表达和纯化, 表达的蛋白经Western blot得到确认.二次电泳后的放射自显影结果显示,第1～10 AA、19～45 AA、80～132 AA片段无RNA结合活性, 而含有10～16 AA,45～80 AA的片段可结合单链和双链RNA.1～29 AA与38～90 AA 2个片段对RNA的结合强度基本相同. 结论丙型肝炎核心蛋白中存在2个RNA结合区,分别定位于10～16 AA及45～80 AA.2个结合区都具有较强的RNA结合活性.制备RNA结合活性缺陷突变体须同时对2个结合区进行突变.
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HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选
目的探讨噬菌体随机肽展示技术在筛选和鉴定病毒抗原序列研究中的应用前景。方法用噬菌粒展示载体pCANTAB5X，构建HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库。用抗-HCV核心单独阳性的血清对该库进行4轮筛选，获得多个阳性克隆，测定和分析8个杂交阳性克隆的DNA序列。结果构建的随机文库含1.23×105个不同克隆，噬菌体滴度为2×1012TU/ml（转化单位/ml）。所测定的7个阳性序列中的6个为HCV核心蛋白序列，这些序列均含有与免疫筛选结果相似的HCV核心抗原序列。另一个为大肠杆菌nrfa基因。结论所建的噬菌体文库有足够大的库容和较好的随机性，可以从该文库中筛选出正确的HCV C抗原序列。噬菌体展示技术完全可应用于病毒蛋白抗原序列的筛选，并具有简便、快速、准确的优点。
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基因1b型HCV核心蛋白不同功能区域对HepG2细胞生长的影响
目的 研究基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株编码的核心蛋白(CORE):癌中心株(T)、癌旁株(NT)、C191(HCV-J6)及同一病毒株(T)编码的不同功能区域(1～172、1～126、1～58、59～126、127～172 AA)在HCV致病机制中的作用,为治疗HCV感染提供靶位.方法 将含有3个不同病毒株(T、NT及C191)及T不同功能区域的CORE真核表达质粒,转染到HepG2细胞,用流式细胞仪检测Annexin Ⅴ/PI,并用细胞生长实时观察仪观察细胞生长曲线.结果 基因1b型T、NT、C191和T不同功能区域的CORE均能诱导HepG2细胞凋亡和坏死且抑制了细胞的生长,其中,T诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长强于NT和C191, T的CORE的N端1～58 AA诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长均高于其他功能区域.结论 HCV基因1b型不同病毒株及同一病毒株编码的CORE不同功能区域的分子致病机制存在一定的差异,N端的1～58 AA在CORE的致病机制中起重要作用,可能是基因治疗的重要靶位之一.
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β-catenin在尖锐湿疣皮损角质形成细胞中的表达
高危型HPV所致尖锐湿疣(condy-loma acuminatum,CA)皮损角质形成细胞的过度增生.可发展为鳞癌或基底细胞癌.β-catenin(β连环素)是环连蛋白家族中的一员,亦是Wnt信号转导系统中的核心蛋白,参与多种细胞的增殖和分化.为探讨β-catenin在尖锐湿疣皮损角质形成细胞过度增生机制中的作用,本研究检测了β-catenin蛋白及β-catenin mRNA在尖锐湿疣皮损角质形成细胞中的表达情况.
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HIV-2 gag rFPV与rDNA疫苗的联合免疫研究
目的探讨HIV-2核心蛋白基因gag重组DNA疫苗与重组鸡痘病毒进行联合免疫引起小鼠的免疫应答,为研究HIV-2基因重组疫苗的免疫策略提供实验基础.方法大量制备并纯化HIV-2 gag重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒,以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾CTL对HIV-2靶细胞的杀伤活性.结果重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒单独免疫及二者联合免疫均刺激小鼠产生HIV-2特异性抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性,但联合免疫组在各项指标上均高于单独免疫组.结论以HIV-2 gag重组DNA疫苗进行基础免疫、以HIV-2 gag重组鸡痘病毒进行加强免疫能诱导小鼠产生更强的特异性细胞和体液免疫应答.
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丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸适配子的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗HCV核心蛋白(C 蛋白)的寡核苷酸适配子(aptamers). 方法利用systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)技术,以HCV C蛋白为靶分子,从体外合成的81bp随机单链DNA文库中筛选与HCV C蛋白特异结合的寡核苷酸适配子,并进行了解离常数(Kd)测定和适配子序列测定.再分别利用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子的一级结构和二级结构. 结果经过9轮循环筛选,随机ssDNA库与HCV C蛋白的结合率从0.5%上升到32.5%.所有的一级结构没有共同的同源序列,但可分5个家族,每个家族具有共同的保守序列.二级结构分析表明,适配子形成的茎环、凸环结构可能是与HCV C蛋白结合的结构基础.其中寡核苷酸适配子C4与HCV C蛋白特异结合的亲和力高,Kd值为68nmol/L. 结论利用随机寡核苷酸文库成功获得抗HCV C蛋白的寡核苷酸适配子.
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含HIV-1核心蛋白基因的重组质粒的构建及其免疫应答的研究
目的构建含有HIV-1核心蛋白gag基因的真核表达质粒,并研究其免疫应答反应.方法采用PCR方法从1例HIV感染者中扩增出gag基因,构建重组质粒pcDNA-GAG.接种小鼠后,检测其抗体及抗体亚类,并对小鼠的淋巴细胞亚群进行分析,采用3H-TdR法、ELISPOT方法和51Cr释放法分别检测T淋巴细胞的增殖反应性、特异性分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞以及特异性CTL杀伤活性.结果重组质粒体外表达目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为55×103.免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体,其中IgG2a与IgG的比例显著高于IgG1与IgG的比例;T淋巴细胞体外经ConA刺激后SI达到160.67,显著高于对照组(14.04,P＜0.05);产生IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数目以及特异杀伤率均显著高于对照组小鼠(P＜0.05).结论重组质粒pcDNA-GAG可诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答反应,而且ELISPOT方法检测特异性细胞免疫应答反应的结果与51Cr释放法一致,提示可用此法对DNA疫苗诱导的细胞免疫进行评价.
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基因1b型HCV不同截短片段核心蛋白在HepG2亚细胞器中的定位表达
目的 为进一步探讨HCV核心蛋白(CORE)在HCV致病机制中的作用,观察基因1b型不同截短片段CORE在瞬时转染HepG2细胞中亚细胞器的分布状况.方法 将含有增强型绿荧光蛋白(EGFP)的3个基因1b型不同准种HCV和同一准种5个不同截短片段的CORE融合蛋白真核表达质粒pEGFF-CORE,瞬时转染HepG2细胞,用荧光显微镜及激光共聚焦观察它们在亚细胞的分布状况.结果 基因1b型不同准种CORE的N端1～172氨基酸(腿)主要表达于胞质,含有N端越长表达于胞质内越多,而N端1～58 aa主要表达于核内,而59～126 aa及127～172 aa胞质和核内均有表达.结论 不同区段CORE在细胞内亚细胞器的表达部位不同,与其在致病机制中功能的发挥可能存在一定的关系.
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一种用于HCV核心蛋白体外表达研究的CHO细胞模型的建立
目的:建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白体外表达的非肝细胞模型.方法:核酸酶切法鉴定含有HCV1b基因型C蛋白编码基因的重组质粒pCMH6K的稳定性,将pCMH6K瞬时及稳定转染于中华仓鼠卵巢(China hamster ovary,CHO)细胞并连续传代110 d,免疫荧光法检测转染细胞内HCV C蛋白分布特征,RT-PCR法检测转染细胞内HCVC mRNA.结果:pCMH6K含有与HCV1b基因型C蛋白编码基因(573 bp)相一致的特异性片段；在pCMH6K瞬时以及稳定转染的CHO细胞内可见HCV C蛋白主要分布在胞质,少部分在胞膜;在不同时期稳定转染CHO细胞中均可见到与HCV C mRNA相一致的基因特异性片段(267 bp).结论:成功建立了能够持续表达HCV C蛋白的CHO细胞株.
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GM-CSF基因增强HCV核心蛋白基因DNA疫苗的免疫应答
目的:研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)编码基因对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白编码基因重组质粒诱导的免疫应答有无增强作用.方法:人工合成HCV核心蛋白基因至克隆载体pUC119上,酶切后与真核表达质粒pCMH6K连接,测序正确后将重组质粒pCMH6K/HCV-C转染中华仓鼠卵巢(China hamster ovary,CHO)细胞.免疫荧光检测转染的CHO细胞中HCV C蛋白分布与表达.将已构建成功的GM-CSF编码基因重组子(pGM-CSF)联合pCMH6K/HCV-C肌注免疫Balb/c鼠,ELISA 法检测免疫小鼠血清抗HCV C特异性抗体水平,经流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾T淋巴细胞亚群及Th细胞内细胞因子[干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)]变化,LDH法测定CTL活性.结果:pCMH6K/HCV-C经鉴定构建正确.所编码的蛋白主要分布于胞膜,少量分布于胞浆.pGM-CSF+pCMH6K/HCV-C联合免疫组和pCMH6K/HCV-C单独免疫组均产生抗HCV C特异性抗体,两组间比较差异无统计学意义;联合免疫组CD4+T淋巴细胞比例为44.90％±5.99％,明显高于其他组(P＜0.05).不同免疫组CD8+T细胞比例变化不大,与空载体pcDNA3.1(+)组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).联合免疫组CTL活性为56.48％±4.68％,明显高于其他组(P＜0.05).联合免疫组IFN-γ/IL-4比值为18.20±2.36,明显高于其他组(P＜0.05).结论:GM-CSF编码基因可增强HCV C基因DNA疫苗的细胞免疫应答,并能够诱导Th1型免疫应答.
关键词： 丙型肝炎病毒 核心蛋白 DNA疫苗 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 -
B和C基因型HBV核心蛋白促细胞凋亡的比较
目的:比较B,C两种基因型HBV核心蛋白在促进肝细胞凋亡方面的差异,以期初步阐述HBV基因型与临床关系的发病机制.方法:用PCR扩增4份(B和C基因型各2份)HBV-C区DNA片段,通过基因重组、分子克隆和亚克隆等方法,合成4份不同基因型和临床表型的重组真核表达质粒.鉴定后,将他们分别转染至肝癌细胞系HepG2中,采用MTT法和流式细胞仪测定转染细胞的细胞增殖率和细胞凋亡率等指标.结果:4份重组真核表达质粒均构建成功,转染至HepG2后通过内参照EGFP可鉴定出均有HBV-C蛋白表达.流式细胞仪提示C型/重型HBV转染组的细胞凋亡率显著高于B型/携带HBV转染组(8.8%±2.0% vs 6.4%±0.8%,P＜0.05).结论:C型HBV核心蛋白较B型HBV更能促进肝细胞凋亡,HBV基因型与临床相关性可能与此有关.
