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丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸适配子的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗HCV核心蛋白(C 蛋白)的寡核苷酸适配子(aptamers). 方法利用systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)技术,以HCV C蛋白为靶分子,从体外合成的81bp随机单链DNA文库中筛选与HCV C蛋白特异结合的寡核苷酸适配子,并进行了解离常数(Kd)测定和适配子序列测定.再分别利用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子的一级结构和二级结构. 结果经过9轮循环筛选,随机ssDNA库与HCV C蛋白的结合率从0.5%上升到32.5%.所有的一级结构没有共同的同源序列,但可分5个家族,每个家族具有共同的保守序列.二级结构分析表明,适配子形成的茎环、凸环结构可能是与HCV C蛋白结合的结构基础.其中寡核苷酸适配子C4与HCV C蛋白特异结合的亲和力高,Kd值为68nmol/L. 结论利用随机寡核苷酸文库成功获得抗HCV C蛋白的寡核苷酸适配子.
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SSCP在寡核苷酸适配子ssDNA多克隆筛选中的应用
目的 利用单链构象多态性技术弥补SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)实验在寡核苷酸适配子克隆、测序环节中的不足,减少SELEX实验的环节.方法 利用单链构象多态性技术(singel-strand conformation polymorphism,SSCP)将多轮SELEX筛选的198个寡核苷酸适配子克隆在测序前进行SSCP筛查.结果 对198个克隆的SSCP电泳条带位置分析,挑选出58个克隆测序.SSCP筛查得到有效克隆的检出率为20.69%,是不用SSCP筛查检出率6.07%的3.4倍;如果去除组间误差,有效克隆的检出率44.44%是不用SSCP筛查检出率的7.32倍.结论 通过对198个克隆的20批次SSCP电泳筛查,并经58个克隆测序后的实验结果证明:同一SSCP电泳胶片上电泳条带泳动位置相同的克隆片段,基因序列相同;电泳条带泳动位置不同的片段,基因序列不同.根据SSCP电泳条带泳动位置,挑选有代表性的克隆测序,避免对多克隆盲目测序,为多克隆测序前的筛查探索一条新的途径.
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寡核苷酸适配子在核医学中的应用
寡核苷酸适配子(aptamer,ataptable oligomer)是用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,通过体外筛选、扩增和富集获得能和小分子物质、多肽、蛋白质、细胞器、核酸及细胞和组织等靶物质高亲和、高特异结合的修饰寡核苷酸.适配子(aptamer)来源于拉丁语"aptus"一词,意为"使适合".
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金纳米颗粒修饰寡核苷酸适配子对蛋白质进行比色检测方法
目的 利用核酸适配体(aptamer)建立一种检测与疾病有关蛋白质的新方法.方法 用金纳米颗粒(Au NP)修饰的寡核苷酸适配子与蛋白质结合,同时另一个生物素化的寡核苷酸适配子也结合于蛋白质,构成一个三明治形式的复合物,接着三明治复合物被卵白素结合于酶标板上,利用银离子强化技术对复合物上的蛋白质浓度信息进行放大,然后用酶标仪对吸光度进行检测.结果 (1)本研究可以得到吸光度与PDGF-BB浓度的剂量-效应关系曲线,在一定的浓度范围内(1 fM～1μM),吸光度与PDGF-BB浓度的对数值呈线形相关,决定系数R2=0.9801;(2)本方法可以检测出1 fmol/L的靶蛋白质.结论 本方法有较高灵敏度,不需要复杂的仪器,易于操作,是一种新颖而应用前景的蛋白质标志物分析方法.
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泡沫细胞靶向适配子的体外筛选
目的 筛选巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子,为动脉粥样硬化的靶向治疗提供实验依据.方法 以80 mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育THP-1巨噬细胞72 h,建立泡沫细胞模型;利用指数富集配基的系统进化技术,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选特异性寡核苷酸适配子;荧光显微镜观察寡核苷酸文库与泡沫细胞结合的特异性;克隆、测序确定适配子的序列并进行一级结构和二级结构分析.结果 通过油红O染色和高效液相色谱分析,确定成功建立泡沫细胞模型;经过18轮的循环筛选,寡核苷酸文库仅与泡沫细胞结合,不再结合巨噬细胞、血管平滑肌细胞.测序鉴定出的所有适配子序列可以分为12个家族,没有共同的同源序列.二级结构分析表明,适配子主要形成茎环结构,这可能是适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的结构基础.结论 利用复合靶指数富集配基的系统进化技术成功筛选出巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子.
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生物素-亲合素ELISA法对ANEPⅢ寡核苷酸适配子亲和力的定量测定
目的: 定量分析SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)筛选中寡核苷酸适配子的亲和力.方法: 利用生物素和亲合素放大系统(BA-辣根过氧化物酶复合物系统)应用于ELISA的实验策略, 对ANEPⅢ寡核苷酸适配子的亲合力进行测定.结果: 确定BA-ELISA方法定量分析测定寡核苷酸适配子的基本实验步骤.结论: BA-ELISA法可以替代IFMA(免疫荧光测定试验)或放射性荧光标记方法进行寡核苷酸适配子的亲和力的定量测定.
