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动脉粥样硬化靶向适配子的亲和力筛选
目的：筛选动脉粥样硬化高亲和力适配子,为动脉粥样硬化靶向引导物的体内应用提供实验基础。方法将前期研究获得的一组巨噬细胞源性泡沫细胞适配子中的12个适配子进行生物素标记,采用酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)方法测定其亲和力(Kd),采用高脂方法建立载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)动脉粥样硬化模型,将亲合力高的适配子Cy5进行荧光标记,激光共聚焦显微镜下观察其与动脉粥样硬化病变组织的结合能力。结果12个巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子均具有较好的亲和力,解离平衡常数(Kd值)范围在4.33~39.58 nmol/L之间,其中9号适配子(Apt9)的亲和力高,Kd值为(4.33±0.33)nmol/L,体内亲和力检测发现Apt9能特异性结合ApoE-/-动脉粥样硬化血管斑块病变组织。结论筛选的Apt9适配子能与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变血管组织特异性结合,可以用于进一步的体内研究。
关键词： 巨噬细胞源性泡沫细胞 适配子 亲和力 动脉粥样硬化 -
泡沫细胞寡核苷酸适配子PM2的特异性研究
目的 研究寡核苷酸适配子对动脉粥样硬化病变组织结合的特异性.方法 将前期研究获得的特异性适配子命名为PM2,FITC标记后,荧光显微镜分别观察适配子与血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、巨噬细胞源性泡沫细胞结合情况.采用高脂方法建立兔的动脉粥样硬化模型.利用PCR方法和荧光显微镜观察适配子与动脉粥样硬化病变结合情况.结果 PM2适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞高度特异性结合,但不与血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞结合;PM2适配子能特异性结合动脉粥样硬化斑块组织,而不结合正常动脉组织结合.结论 筛选出的PM2适配子特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变.
关键词： SELEX 特异性 巨噬细胞源性泡沫细胞 动脉粥样硬化病变 -
Cell SELEX技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子的初步研究
目的 利用Cell SELEX 技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子.方法 通过80 mg/L 氧化性低密度脂蛋白诱导THP-1 巨噬细胞为泡沫细胞;聚合酶链反应扩增文库;生物素- 链霉亲和素磁珠分离法构建单链DNA 文库;以巨噬细胞源性泡沫细胞为靶细胞,巨噬细胞和血管平滑肌细胞为反筛细胞,利用Cell SELEX 技术筛选与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的寡核苷酸序列,并对后一轮筛选结果进行克隆测序.结果 PCR 的退火温度对PCR 产物的量有显著的影响,退火温度由65℃提高为72℃时的产物量明显增加.利用生物素- 链霉亲和素磁珠分离法获得了纯度高、产量大的ssDNA文库;经过18 轮筛选后,成功获得了28 个与预期大小相同的ssDNA 序列.结论 利用Cell SELEX 技术筛选出了巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子,为研发用于动脉粥样硬化的早期无创诊断试剂和靶向治疗药物奠定了基础.
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PDE抑制剂对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出的影响
目的:探讨巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达对胆固醇流出的影响.方法:以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,使用液体闪烁计数器检验细胞内胆固醇流出情况;同时采用逆转录-多聚酶链反应和Western blot印记分别检验ABCA1mRNA与ABCA1蛋白的表达,以低pH值EIA法测定细胞内cAMP水平.实验结果表明,PDE4抑制剂能够引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞cAMP水平、ABCA1表达、胆固醇流出增加,细胞内总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇值检测结果则明显降低.结论:PDE4抑制剂能够增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达以及胆固醇流出,这也许是预防与治疗动脉粥样硬化的新的研究方向.
关键词： PDE抑制剂 巨噬细胞源性泡沫细胞 ABCA1的表达 胆固醇流出 -
刺梨汁对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响
目的:探讨刺梨汁的抗动脉粥样硬化机制.方法:在刺梨汁参与下,氧化的极低密度脂蛋白(Ox-VLDL)与小鼠腹腔巨噬细胞孵育一段时间,通过测定细胞胆固醇含量和观察细胞形态改变,分析刺梨汁对Ox-VLDL促泡沫细胞形成的影响.结果:较低浓度的刺梨汁能明显抑制Ox-VLDL对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇酯的堆积(P<0.001),并呈浓度依赖性.刺梨汁浓度为2 μl/ml和4 μl/ml时,Ox-VLDL堆积的细胞胆固醇酯含量分别被抑制了59.8%和90.1%.形态学观察显示,经刺梨汁处理的巨噬细胞猩红阳性染色显著减少.结论:刺梨汁通过抑制Ox-VLDL的促泡沫细胞形成来实现其抗动脉硬化的功能.
关键词： 刺梨汁 极低密度脂蛋白 氧化修饰 巨噬细胞源性泡沫细胞 动脉粥样硬化 -
护心方对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出及ABCA1表达的影响
目的 观察护心方对THP-1细胞源性泡沫细胞ApoAI介导的胆固醇流出及ABCA1表达的影响.方法 THP-1细胞诱导分化成巨噬细胞后,在ox-LDL刺激48 h,使巨噬细胞转化为泡沫细胞,以护心方含药血清作用24 h.采用液体闪烁计数法观察细胞内胆固醇的流出,Western blot检测细胞ABCA1的蛋白表达水平,qPCR检测细胞ABCA1的mRNA表达水平.结果 护心方含药血清可增加泡沫细胞胆固醇的流出且呈时间依赖性(P＜0.05),同时能上调诱导后的泡沫细胞ABCA1蛋白水平(P＜0.05),但对ABCA1 mRNA的表达水平无影响.结论 护心方可通过提高泡沫细胞ABCA1蛋白表达水平,增加细胞内ApoAI介导的胆固醇流出,是其临床治疗动脉粥样硬化的机制之一.
关键词： 护心方 巨噬细胞源性泡沫细胞 胆固醇逆向转运 ATP结合盒转运体A1 -
NgBR对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响
目的 通过转染小干扰RNA(siRNA)沉默RAW264.7细胞源性泡沫细胞神经轴突生长抑制因子B受体(NgBR)表达,研究NgBR对泡沫细胞胆固醇逆转运(RCT)的影响,探索从RCT途径抗动脉粥样硬化(As)的新方法,为冠心病的临床防治提供新思路.方法 利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导RAW264.7细胞形成泡沫细胞,油红O染色进行鉴定.将泡沫细胞分为四组:空白对照组、siRNA阴性对照组、NgBR-siRNA1转染组(siNgBR-1组)、NgBR-siRNA2转染组(siNgBR-2组).利用siRNA沉默泡沫细胞NgBR基因表达,并利用real-time PCR和Western blot对其进行干扰效率鉴定.随后采用real-time PCR检测各组细胞肝X受体α(LXRα)、三磷酸腺苷结合盒转运体A1 (ABCA1)及三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1) mRNA表达,Western blot检测各组细胞相应蛋白含量,液闪计数仪检测胆固醇流出率.结果 ox-LDL成功诱导泡沫细胞形成;siNgBR-1组和siNgBR-2组NgBRmRNA及其蛋白明显下调(P＜0.05);siNgBR-1组和siNgBR-2组LXRd、ABCA1和ABCG1的mRNA及其蛋白表达显著降低(P＜0.05),胆固醇流出显著减少(P＜0.05).结论 NgBR可以增加巨噬细胞源性泡沫细胞RCT的调控基因LXRα及其下游基因ABCA1、ABCG1的表达,从而减弱或者避免As的发生和发展,为冠心病的临床防治提供理论依据.
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丹参酮Ⅱ A对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞蛋白质组的影响
目的 应用双向电泳和质谱技术研究丹参酮Ⅱ A对ox-LDL诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞蛋白质组的影响,探讨丹参酮Ⅱ A调脂和抗动脉粥样硬化作用的分子机制.方法 分离纯化获得人血清低密度脂蛋白(LDL),用CuSO4进行氧化得到ox-LDL,与RAW264.7细胞共孵育,形成的泡沫细胞用含20 mg/L丹参酮Ⅱ A继续培养24h作为丹参酮组,不合丹参酮Ⅱ A的溶液培养24h作为对照组,经超声破碎细胞,离心,取上清进行蛋白质定量,丹参酮Ⅱ A组和对照组蛋白质等量上样,进行双向电泳,电泳完毕后用硝酸银染色得到不同样品的蛋白质组图谱.经Labscan软件进行差异蛋白质组分析,选取蛋白质表达量差异超过2倍的蛋白质作为差异蛋白.经胶内酶解及质谱分析,得到肽质量指纹图谱,通过Mascot数据库搜索,结合2-D图谱上蛋白质的分子量、等电点信息鉴定蛋白质.结果 丹参酮组钙网蛋白、波形蛋白、过氧化物酶2、CuZn-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、亮氨酸拉链蛋白、stabilin-1、造血细胞系特异性蛋白表达量增加,而GTP蛋白、ATP合酶、mimitin、IL-5、热休克蛋白70(HSP70)、翻译控制肿瘤蛋白、氯离子通道蛋白1表达量降低.结论 丹参酮Ⅱ A通过降低GTP蛋白和HSP70表达以及提高钙网蛋白表达改善泡沫细胞对脂代谢的调控功能;通过提高stabilin-1表达和降低ATP合酶表达调节细胞的吞噬能力;通过提高亮氨酸拉链蛋白和波形蛋白表达促进脂与脂蛋白的代谢;通过提高过氧化物酶2和CuZn-SOD表达起到清除氧自由基和抗脂质过氧化作用;通过降低mimitin和IL-5表达以及提高造血细胞系特异性蛋白表达而具有抗炎和抗细胞凋亡作用;通过降低氯离子通道蛋白1和翻译控制肿瘤蛋白表达具有抗肿瘤作用.因此可以认为丹参酮Ⅱ A可能具有调节血脂和抗动脉粥样硬化作用,在临床上可以用于心脑血管疾病的治疗.
关键词： 蛋白质组 丹参酮Ⅱ A 氧化型低密度脂蛋白 巨噬细胞源性泡沫细胞 -
锌指蛋白去磷酸化在载脂蛋白AⅠ抑制脂多糖诱导的泡沫细胞炎症因子表达中的作用
目的 观察载脂蛋白A Ⅰ (ApoA Ⅰ)对脂多糖诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子表达的影响,探讨锌指蛋白(TTP)翻译后修饰在ApoA Ⅰ抑制泡沫细胞炎症因子表达中的作用.方法 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞以ApoA Ⅰ和/或脂多糖处理,采用ELISA检测细胞裂解液中炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)蛋白表达;采用实时定量PCR检测IL-1β mRNA表达和降解率;采用Western blot检测TTP和磷酸化TP(p-TTP)的表达.结果 ApoA Ⅰ明显抑制脂多糖诱导泡沫细胞炎症因子的表达,并影响TTP表达和TTP去磷酸化.结论 ApoA Ⅰ抑制泡沫细胞炎症因子表达机制涉及TTP的去磷酸化,与TTP促进含有腺苷酸环尿苷酸丰富的元件(ARE)的mRNA降解有关.
关键词： 锌指蛋白 载脂蛋白AⅠ 巨噬细胞源性泡沫细胞 炎症因子 -
泡沫细胞靶向适配子的体外筛选
目的 筛选巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子,为动脉粥样硬化的靶向治疗提供实验依据.方法 以80 mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育THP-1巨噬细胞72 h,建立泡沫细胞模型;利用指数富集配基的系统进化技术,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选特异性寡核苷酸适配子;荧光显微镜观察寡核苷酸文库与泡沫细胞结合的特异性;克隆、测序确定适配子的序列并进行一级结构和二级结构分析.结果 通过油红O染色和高效液相色谱分析,确定成功建立泡沫细胞模型;经过18轮的循环筛选,寡核苷酸文库仅与泡沫细胞结合,不再结合巨噬细胞、血管平滑肌细胞.测序鉴定出的所有适配子序列可以分为12个家族,没有共同的同源序列.二级结构分析表明,适配子主要形成茎环结构,这可能是适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的结构基础.结论 利用复合靶指数富集配基的系统进化技术成功筛选出巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子.
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巨噬细胞源性泡沫细胞适配子PM1的特异性
目的 研究特异性寡核苷酸适配子PM1与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变结合的特异性,为动脉粥样硬化的体内靶向治疗提供实验依据.方法 对适配子PM1进行FITC标记,荧光显微镜分别观察适配子与血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、巨噬细胞源性泡沫细胞结合情况.采用高脂方法建立兔动脉粥样硬化模型,利用PCR方法和荧光显微镜观察适配子与动脉粥样硬化病变结合情况.结果 适配子PM1与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变组织高度特异性结合,但不结合血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞和正常动脉组织.结论 筛选出的适配子PM1能特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变.
关键词： 适配子 巨噬细胞源性泡沫细胞 动脉粥样硬化病变 -
中药虎杖和山楂提取物对载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞PPARγ、ABCA1及CD36 mRNA表达的影响
目的 观察中药虎杖、山楂配伍对栽脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内过氧化体增殖物激活型受体γ、三磷酸腺苷结合盒转运子A1及cD36 mRNA表达的影响,从基因水平探讨虎杖和山楂配伍对动脉粥样硬化泡沫细胞形成的干预机制.方法 培养载脂蛋白E基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞,分为空白组、虎杖苷组、山楂提取物组、虎杖苷+山楂提取物组、洛伐他汀组、罗格列酮组及模型组.除空白组外,其他各组均同时加入氧化型低密度脂蛋白及脂多糖.各组细胞在培养箱内共孵育(泡沫化)2天,以逆转录聚合酶链反应法检测0 h、24 h和48 h各组细胞内过氧化体增殖物激活型受体γ、三磷酸腺苷结合盒转运子A1及CD36的mRNA表达.结果与空白组比较,干预24 h和48 h后,模型组及各用药组三个指标的表达均显著增高(P<0.01);与模型组比较,干预24 h后,虎杖苷+山楂提取物组和罗格列酮组过氧化体增殖物激活型受体γ mRNA表达显著增高,虎杖苷组、虎杖苷+山楂提取物组和罗格列酮组三磷酸腺苷结合盒转运子A1 mRNA表达显著增高(P<0.05或P<0.01),各用药组CD36 mRNA表达无显著差异(P>0.05);干预48 h后,各用药组过氧化体增殖物激活型受体γ和三磷酸腺苷结合盒转运子A1 mRNA表达均显著增高,CD36 mRNA表达显著降低,且虎杖苷+山楂提取物组优于虎杖苷组、山楂提取物组及洛伐他汀组(P<0.05或P<0.01).结论 虎杖和山楂配伍可能具有与罗格列酮相似的过氧化体增殖物激活型受体γ激动作用,通过上调栽脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞过氧化体增殖物激活型受体γ和三磷酸腺苷结合盒转运子A1 mRNA表迭、下调CD36 mRNA表达的调控途径显著抑制巨噬细胞泡沫化过程,阻止动脉粥样硬化进程.
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巨噬细胞源性泡沫细胞是动脉粥样硬化治疗的新靶点
巨噬细胞是机体防御系统的重要细胞成分之一,其特有功能是能够保护机体抵抗感染.巨噬细胞具有内吞脂质、释放氧化物及免疫介质的能力,与动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的发生发展密切相关.
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ABCA1的转录和转录后水平调控研究新进展
三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）能介导细胞内脂质流出，形成高密度脂蛋白（HDL），抑制动脉粥样硬化的发生发展，起到心血管保护作用。在转录和转录后水平，ABCA1的表达均受到严密调控。研究发现，在非人类灵长类动物，miR－33能靶向结合ABCA1，调控体内脂质代谢，即升高HDL，降低极低密度脂蛋白（ VLDL）水平。本课题组研究结果显示，GDF－15通过PI3K－PKCζ－SP1通路上调THP－1巨噬细胞ABCA1蛋白水平，从而促进细胞内胆固醇流出；ELK－2A2K2E通过ABCA1经JAK2－STAT3信号途径促进TTP的表达，进而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的炎症因子；miR－27a／b能够通过靶向沉默ABCA1减少细胞内的游离胆固醇流出；NF－κB通过上调SREBPs的内含子型miR－33s，抑制ABCA1的表达和胆固醇流出，导致巨噬细胞脂质蓄积；tBHQ通过激活Nrf2／HO－1信号途径，抑制calpain活性，减少ABCA1蛋白降解，从而增加ABCA1的蛋白水平，促进细胞内胆固醇流出。因此各种因素共同调控ABCA1的表达，终影响胆固醇流出和动脉粥样硬化的发生发展。
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同型半胱氨酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的影响
目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的形成及细胞内胆固醇流出的影响.方法 首先以160 nmol·L-1的佛波酯(PMA)刺激THP-1单核细胞48 h使其分化为巨噬细胞,继之用含0、50、100、200 μmol·L-1的Hcy和100 mg·L-1的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育24 h,使其转化为泡沫细胞.采用油红O染色进行泡沫细胞定性分析,泡沫细胞面积计数法进行半定量分析,总胆固醇和游离胆固醇测定法进行定量分析.结果 经PMA处理48 h后,呈簇集状悬浮状态的单核细胞分化为形态不规则、有伪足并贴壁的巨噬细胞,继之经Hcy和ox-LDL处理后的细胞中出现了大量红染的脂滴,细胞呈现泡沫化改变;细胞面积计数法显示实验组较对照组而言泡沫细胞阳性率升高(P＜0.05),以100 μmol·L-1 Hcy组明显(P＜0.05);酶终点法测定胆固醇流出结果显示,实验组的胆固醇酯相对值明显高于对照组(P＜0.05).结论 成功建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型,Hcy减少了细胞内胆固醇的流出,在动脉粥样硬化的发生发展中扮演重要作用.
关键词： 动脉粥样硬化 同型半胱氨酸 巨噬细胞源性泡沫细胞 胆固醇流出
