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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制EV71复制
目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝( MTT)法测定细胞毒性，转染后接种病毒观察细胞病变作用( CPE)，荧光定量RT-PCR法检测EV71含量，免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定 Cas9-gRNA 在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合的能力。结果成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒；转染细胞后未见明显细胞毒性效应；细胞转染后接种病毒发现pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组细胞病变明显少于其他对照组；培养上清中 EV71含量较对照组降低了40.4%(P=0.056)，细胞中 EV71含量较对照组降低了52.8%(P=0.014)；pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合能力高。结论针对 EV71的 VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用，可以为EV71治疗提供新的途径。
关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术 肠道病毒71型 病毒复制 抑制 -
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制HBV复制
目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对乙型肝炎病毒( HBV)的特定基因进行编辑，评价其抑制HBV复制的效应。方法针对HBV的S 基因设计2套CRISPR/Cas9表达质粒并转染HepG2-N10细胞株。采用噻唑蓝( MTT)法测定细胞毒性、化学发光法检测HBsAg、荧光定量RT-PCR( qRT-PCR)法检测病毒mRNA表达水平，荧光定量PCR( qRT-PCR)法检测HBV DNA含量，高通量测序分析HBV基因组编辑情况。结果未见明显细胞毒性效应；2套针对HBV的CRISPR/Cas9表达质粒组培养基中HBsAg含量较对照组降低了24.2%(P=0.031)和16.9%(P>0.05)，细胞中HBsAg含量分别降低了16.4%(P>0.05)和32.1%(P>0.05)；S、C、X基因mRNA基因表达呈现不同程度降低；培养上清中HBV DNA含量较对照组降低了23%(P>0.05)和35%(P=0.047)，细胞中HBV DNA含量降低了7.2%(P>0.05)和18%(P>0.05)；高通量测序提示HBV基因组出现不同类型的插入/缺失突变。结论针对HBV的S 基因设计的2套CRISPR/Cas9表达质粒能通过对HBV基因组的编辑实现抑制HBV基因表达及病毒复制作用，可能为HBV治疗提供新的途径。
关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术 乙型肝炎病毒 抑制 -
CRISPR/Cas9基因编辑技术在精神分裂症研究和治疗中的应用前景综述
精神分裂症是多发于青壮年的精神障碍性疾病之一,至今病因未明.遗传学研究结果显示遗传因素在精神分裂症发病过程中起着重要作用,它是一种具有遗传性的脑基因异常表达疾病.近年来大量的和分裂症有关的基因被鉴定和标记,治疗上依赖于新型的基因编辑工具进行基因的再编辑,从而治疗精神分裂症.本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用.
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用
规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因编辑技术是新涌现的一种基因编辑技术,它能精准完成RNA导向的DNA识别及编辑,为构建更高效的基因编辑技术提供了可能,目前科研人员已经可以实现在碱基水平对基因进行定点修饰.CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于肿瘤研究中.本文对CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因编辑中的分子机制及其在临床治疗和肿瘤研究中应用的研究进展进行综述.
关键词： 肿瘤 基因治疗 CRISPR/Cas9基因编辑技术 -
应用基因编辑技术探索建立中枢神经系统动静脉畸形小鼠模型
目的 采用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Alk1基因,探讨条件性敲除Alk1建立中枢神经系统动静脉畸形动物模型的可行性.方法 利用CRISPR/Cas9技术在小鼠Alkl基因的特定位点插入两个LoxP序列;经传代并与SM22-Cre小鼠交配后培育出Alk12LoxP/2LoxP/Cre目标小鼠.该目标小鼠8周龄时通过他莫昔芬腹腔注射激活Cre重组酶的表达,从而条件性敲除Alkl基因诱导脑动静脉畸形的生成.2周后取小鼠脑组织标本,进行苏木精-伊红染色和病理分析.结果 7只目标小鼠中,2只脑组织病理切片发现管腔大小不一的异常血管病灶.结论 条件性敲除Alkl基因可初步建立中枢神经系统动静脉畸形动物模型.
关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术 ALK1 脑动静脉畸形 模型 小鼠 -
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7StxⅡ基因表达
目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC) O157∶H7 StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性.方法 针对EHEC O157∶H7 StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况.结果 测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均＞0.05).pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30％)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097 (CPE均＞80％).结论 成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7 StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础.
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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤治疗中的应用
CRISPR/Cas9基因编辑系统是在古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制基础上人工改造而成的一种新型基因编辑技术.由于其高效率和准确性,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经广泛应用于肿瘤治疗的研究中,如靶向敲除致癌基因、修复抑癌基因、打破免疫耐受、构建肿瘤模型等,为肿瘤基因治疗带来革命性的发展.
关键词： 肿瘤 治疗应用 CRISPR/Cas9基因编辑技术 -
五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展
为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容.本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展.
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中的伦理审查问题探讨
目的 探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中引发的伦理审查问题,为临床研究中涉及该技术的伦理审查注意事项提供参考.方法 总结国内外CRISPR/Cas9基因编辑技术存在的伦理问题,分析其原因并提出符合我国国情新技术应用的建议.结果 应该允许将基因编辑技术应用于体细胞基因治疗,禁止用于生殖系基因治疗和不考虑用来增强;鉴于CRISPR/Cas9缺乏明确的责任伦理主体,带来安全性、权利冲突和社会公平问题,需采取的措施包括加强文化沟通、尽快形成基因编辑技术伦理规范、在国家层面上设立独立的基因编辑技术项目伦理审查机构、健全法律规范、制定技术标准和伦理准则以及在国家层面应对基因编辑研究领域进行重点支持.结论 鉴于CRISPR/Cas9技术潜在的临床应用,国家应逐步从禁止到限制性开展人类胚胎基因编辑技术的研究.伦理委员会要负起临床研究的伦理审查和监管.伦理委员会委员和伦理工作人员应加强相关新知识的学习,从受理涉及CRISPR/Cas9技术的临床科研项目到伦理审查都严格对接政策法规,确保有效审查基因编辑技术项目的伦理问题.
关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术 临床研究 伦理审查
