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苯并(a)芘通过活化蛋白-1非依赖性通路诱导细胞中p53蛋白过表达及高磷酸化
目的 探讨笨并(a)芘[B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中p53蛋白、p53磷酸化水平及亚细胞分布和活化蛋白-1(AP-1)活性的改变,以及p53与AP-1的上下游关系.方法 转染p53小干扰RNAp53 siRNA质粒(p53-H)、载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)和转染AP-1荧光报告质粒的HELF细胞(AP-H)无血清培养48h后,加入2μmol/L B(a)P作用24h,用Western blot及免疫荧光法检测细胞中p53蛋白及p53磷酸化的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位,用荧光检测法检测AP-1的相对活性.用AP-1的化学抑制刺curcumin抑制其活性,用p53的化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察了二者的上下游关系.结果 2μmol/L B(a)P作用24h后细胞内p53蛋白及p53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平增加,并且主要分布在细胞核内;AP-1的活性增加.抑制AP-1活性后,对B(a)P诱导的p53蛋白含量增加没有明显的影响;抑制D53表达后,对B(a)P诱导的AP-1活性的增加没有明显影响.结论 B(a)P通过AP-1非依赖的信号通路引起人胚肺成纤维细胞p53蛋白含量的增加.
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结核杆菌H37Rv株重组PstS1蛋白的表达纯化及其免疫反应性分析
目的:表达、纯化结核杆菌H37Rv株重组Psts1(简称rPstS1)蛋白,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础.方法:重组质粒pET15b-Pstsl转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rPstSI蛋白表达.经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达条件,用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rPstsl蛋白,并用斑点金免疫渗滤法评价纯化蛋白的免疫反应性.结果成功构建了重组质粒pET15b-Psts1,相对分子质量为38×103的rPstSI蛋白约有30%以可溶性蛋白形式表达,经亲和层析后的rPsts1蛋白纯度为94.8%,有较好的免疫反应性.结论:构建的重组质粒pET15b-PstS1能高效表达有免疫反应性的rPstS1蛋白,经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白.
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冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能
目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因IrCYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化.方法:根据转录组测序所得的IrCYP71基因片段,克隆出全长cDNA序列;构建pET28a(+)-IrCYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析.基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-IrCYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位.结果:克隆得到的IrCYP71基因全长cDNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在GenBank注册(登录号MG800628).经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 kDa左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85％.此蛋白亚细胞定位在细胞核.结论:对冬凌草IrCYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述.
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川牛膝CoObgC基因克隆、亚细胞定立及表达分析
根据川牛膝基因组数据提供的基因序列合成特异性引物,利用常规PCR方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆川牛膝ObgC(GeneBank登录号KU847910)全长cDNA序列,克隆获得2 226 bp全长CoObgC序列,开放阅读框为1 818 bp,编码605个氨基酸序列,预测CoObgC蛋白相对分子质量为66.39 kDa,等电点p1 5.35,为稳定蛋白,并进行多重序列比对和构建系统进化树分析.以川牛膝actin为内参,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CoObgC基因在川牛膝根、茎、叶、花4种组织中表达特征,结果显示在叶片中表达丰度高,其次为根、花、茎;构建pCABIA2300-CoObgC重组载体,利用农杆菌介导法在烟草中进行瞬时表达,激光扫描共聚焦显微镜观察显示川牛膝CoObgC定位于叶绿体.该研究为进一步解析Obg基因的结构和功能,开展川牛膝分子生物学研究奠定基础.
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穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达
从穿心莲叶片中克隆了1个NAC家族的转录因子,命名为ApNAC1,GenBank注册号为KY196416.生物信息学分析表明该基因的完整编码区包含972bp,编码1个323个氨基酸的多肽,预测蛋白相对分子质量为35.9kDa,等电点为6.14.原生质体瞬时表达研究证实了ApNAC1-GFP融合蛋白特异定位在穿心莲叶肉细胞的细胞核中,是一个核定位蛋白.实时定量PCR结果表明ApNAC1基因表达与穿心莲内酯的积累模式一致:主要在穿心莲的叶片里表达,而且茉莉酸甲酯处理能急剧上调其表达水平.ApNAC1基因在大肠杆菌中进行异源表达,并且被成功纯化.该研究为进一步探索ApNAC1蛋白参与穿心莲内酯生物合成的研究奠定了基础.
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丹参ERF转录因子SmERF1基因的表达分析和亚细胞定位
目的:对前期已经克隆的丹参SmERF1基因进行聚类分析,分析SmERFI基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况；并对其进行亚细胞定位分析.方法:利用MEGA5软件对SmERF1基因及拟南芥ERF基因家族进行聚类分析；利用半定量RT-PCR方法,分析SmERF1基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况；将SmERF1与GFP融合,在洋葱表皮瞬时表达,以确定SmERF1蛋白表达部位.结果:丹参SmERF1属于ERF家族第Ⅶ亚族；YE+ Ag+诱导对SmERF1基因的表达没有影响,ABA和MeJA可以抑制该基因的表达,而水杨酸诱导会出现先抑制,后随处理时间加长,SmERF1基因表达又恢复；亚细胞定位确定SmERFI基因在细胞核内特异表达.结论:SmE RF是一个AP2/ERF转录因子,属于AP2/ERF家族第Ⅶ亚族,其表达受ABA,SA,MeJA等激素调节控制.
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鸭瘟病毒UL35基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主中的亚细胞定位
根据本实验室获得的鸭瘟病毒(DPV)UL35基因序列(GenBank登录号:EF643558),利用Oligo6.0和Primer5.0软件设计一对引物,PCR扩增出DPV CHv强毒株UL35基因,随后将其克隆至pMD18-T构建克隆质粒pMD18-T-UL35,经PCR和酶切鉴定后亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+),获得表达质粒pET-32a (+)-UL35后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经1.0mmol/L的IPTG在34℃诱导5h获得佳表达.SDSPAGE分析表明UL35基因表达的重组蛋白(VP26)分子量约为33kD,薄层扫描分析结果显示VP26占菌体总蛋白的32.3%,主要以包涵体的形式存在.经Ni+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化后免疫家兔制备抗VP26重组蛋白血清,血清琼脂扩散试验抗体滴度检测结果达1:32.用High-Q阴离子交换层析纯化抗血清获得兔抗VP26重组蛋白IgG,经Western blot检测显示抗血清可与VP26发生特异性反应.通过免疫荧光技术进行DPV VP26亚细胞定位检测,结果表明DPV感染DEF后2～8h细胞核内荧光的量相对较少,12～36h逐渐增加,48～72h达到多,并且在细胞核内的斑点区域聚集呈颗粒状分布;而在细胞质内12h才开始出现少量荧光,荧光量在DPV感染后24～48h期间随感染时间延长而增加,在感染后72h多.以上结果为阐明和进一步开展DPV UL35基因的功能研究提供了重要数据和材料.
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绵羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env构建及引起NIH3T3细胞恶性转化的研究
为了构建绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达质粒并观察绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在293T细胞中的定位情况以及探讨是否可诱导NIH3T3细胞发生恶性转化,本研究采用RT-PCR技术从自然感染绵羊肺腺瘤病的病羊肺组织中克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env),并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中.构建好真核表达质粒经PCR、酶切和测序鉴定.同时对exJSRV-env基因进行生物信息学分析.采用脂质体法将该重组质粒转染293T细胞,观察其在真核细胞中的表达及定位情况.将该重组质粒转染NIH3T3细胞,观察细胞是否发生恶性转化.用软琼脂集落实验检查转染重组质粒的NIH3T3细胞的生长状态.结果显示真核表达质粒构建成功并命名为pEGFP-C1/exJSRV-env.exJSRV囊膜蛋白的氨基酸序列与参考株比对发现该囊膜基因的跨膜区(TM区)的胞质尾区具有外源性病毒特有的YXXM基序.系统进化树也表明我们克隆的exJSRV-env基因属于致病性的外源性病毒.运用生物信息学技术分析env基因编码的蛋白质的基本性质,并预测其可能的结构.亚细胞定位表明exJSRV囊膜蛋白主要分布于细胞膜.转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒的NIH3T3细胞接触抑制性消失,可在软琼脂中形成集落.说明绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白可引起NIH3T3细胞发生恶性转化.研究结果为进一步探讨exJSRV囊膜蛋白的结构和功能及其致病机理提供了实验基础.
关键词： 外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因 囊膜蛋白 亚细胞定位 细胞转化 -
丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究
以杆状病毒-昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac为模型,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨.根据核心蛋白的亲水性分析结果,设计了三种长度的基因片段(C173、C191和C215),经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,获得三种重组病毒(rvBACC173、rvBACC191和rvBACC215)用于表达分析.SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验表明,昆虫细胞能够识别核心蛋白第191和192位氨基酸之间的切点并低效率切割;但不能够识别173～191位之间的切点.间接免疫荧光试验表明,截断型核心蛋白C173定位于细胞核内,而C191和C215则停留在细胞浆中.rvBACC173感染的细胞在核内出现单一的"类晶体样结构",电子显微镜分析证实,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体.试验结果还表明,第173至191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达,并且影响蛋白在细胞内的分布.间接ELISA实验证实,部分纯化的核心蛋白可用作诊断试剂检测人血清中的特异性抗体.
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Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究
为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV) UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中.将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定.用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体.通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白.同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位.结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体.该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础.
关键词： Ⅰ型马立克病毒(MDV) UL24基因 多克隆抗体 鉴定 亚细胞定位 -
草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的研究
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是当前引起我国草鱼出血病的主要病原,其外衣壳蛋白通常在病毒的组织嗜性和细胞嗜性上发挥重要作用.本研究利用共定位、Dot-Blot技术和His-Pull Down技术,验证了草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用.将pDsRed1N1-VP7,pDsRed1N1-VP56分别与pEG-FP-Fibulin-4共转染草鱼性腺细胞GCO.结果显示,病毒蛋白VP7,VP56和草鱼蛋白Fibulin 4均分布于细胞质中,两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠.应用Dot-Blot Overlay技术,将纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上,经过His-VP7,His-VP56蛋白的孵育,结果表明随着杂交的蛋白量从低到高,蛋白信号由弱到强,His-VP7与His-VP56都能够吸附于GST-Fibulin-4蛋白上并发生相互作用,而不能吸附GST蛋白.利用Pull Down技术,裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白,结合His-VP7,His-VP56的HisPur CobaltResin,在Elution中均能检测到GFP-Fibulin-4蛋白质,而检测不到对照蛋白质GFP,进一步证实了VP7,VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用.
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马疱疹病毒1型囊膜蛋白gD多克隆抗体制备及亚细胞定位
本研究通过间接免疫荧光技术,确定了EHV-1囊膜蛋白gD单独表达于BHK-21细胞内的亚细胞定位情况,为其亚细胞定位机制及病毒二级囊膜的研究奠定了基础.以EHV-1基因组为模板,利用PCR方法扩增gD部分基因,并构建其原核表达载体pET28-gD,转入BL21(DE3)感受态细胞内进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化gD重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫实验小鼠并制备抗囊膜蛋白gD的多克隆抗体;分别以间接ELISA方法及Western blot方法检测抗体效价及反应性;人工转染pVAX-Kozak-gD重组质粒至BHK-21细胞,利用IF技术对囊膜蛋白gD进行亚细胞定位.结果表明:成功表达了大小约29 kD的gD重组蛋白;制备的多克隆抗体效价为1∶102 400,能较好地与囊膜蛋白gD真核表达产物特异性结合;通过IF方法确定囊膜蛋白gD大部分呈斑点状分布于宿主细胞核周围的胞质中,极少量定位于细胞核内.
关键词： 马疱疹病毒1型(EHV-1) 囊膜蛋白gD 多克隆抗体 亚细胞定位 -
蛋白亚细胞定位的预测方法研究
预测蛋白质的亚细胞定位信息对于了解其功能有重要的意义.选择氨基酸组成、氨基酸对组成、位置特异性打分矩阵三种分类特征以及模糊k近邻、支持向量机两种预测方法,分别进行了测试.对预测结果的分析显示,位置特异性打分矩阵可以提高对不同亚细胞器的可区分性;而支持向量机可以更好地利用位置特刎异性打分矩阵特征进行预测.使用氨基酸组成和位置特异性打分矩阵两种特征,并结合支持向量机,是一种有效的亚细胞定位预测方法.
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肿瘤抑制因子PTEN亚细胞定位与缺血-缺氧性脑损伤
第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源等位基因(PTEN)具有脂质和蛋白双重磷酸酶活性.脑组织缺血-缺氧后PTEN发生活化并向线粒体或胞核内转移,而这种在神经元内的不同亚细胞定位可能终决定细胞命运.因此,阐明PTEN在脑缺血-缺氧后的亚细胞定位机制,将为各种急慢性神经退行性变疾病的靶向治疗和药物研发提供新思路.
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锌指蛋白ZNF580定位在MGC803细胞核
新基因(AF184939)ZNF580是由本组克隆并于Genbank 注册的C2H2型锌指蛋白转录因子基因,其cDNA 748～1266 bp之间的碱基构成一个完整的开放阅读框,编码172个氨基酸.蛋白功能基序分析表明:其羧基端序列中含有3个重复串联的C2H2型锌指蛋白主构域:CX2CX3FX5LX2HX3H(X代表保守性差的氨基酸),富含脯氨酸残基的氨基端序列为转录激活结构域[1].利用绿色荧光(green fluorescence protein,GFP)在活细胞内的示踪作用[2],我们将GFP与ZNF580cDNA开读框融合,导入胃癌MGC803细胞株中,直观地观察到ZNF580基因在细胞内的表达及亚细胞定位,为阐明新基因ZNF580的功能奠定了基础.
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α-突触核蛋白在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位
目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein)在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位,为阐明其正常的生理功能提供线索.方法超小金标记结合银增强免疫电镜技术.结果α-突触核蛋白不仅存在于神经细胞的突触前终末,也见于神经细胞的轴突、胞浆与核中.在突触前终末,α-突触核蛋白的分布与突触小泡无明显的关系.在神经细胞核内,靠近核膜部分α-突触核蛋白的分布较为密集,细胞核中心部位α-突触核蛋白则较为稀疏.在胞浆和轴突中,α-突触核蛋白散在分布.另外,在线粒体中也有该蛋白表达.结论α-突触核蛋白广泛分布于神经元的各个部位,可能参与神经元的多种生理功能.
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结核杆菌H37Rv株重组KatG蛋白的表达纯化研究
目的 表达纯化结核杆菌H37Rv株重组KatG(简称rKatG)蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础.方法 重组质粒pET23b-KatG转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rkatG蛋白表达.经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达条件,用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rKatG蛋白,对纯化产物进行过氧化氢酶活性测定.结果 成功构建了重组质粒pET23b-KatG,rKatG蛋白以可溶性蛋白形式表达,经亲和层析后的rKatG蛋白纯度为95.6%,过氧化氢酶试验阳性.结论 构建的pET23b-KatG重组质粒能高效表达有酶活性的可溶性rKatG蛋白,经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白.
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蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素特异性多克隆抗体的制备及免疫电镜定位研究
目的 制备针对蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的特异性抗体,免疫胶体金电镜观察该贾第素的亚细胞定位.方法 生物信息学分析并合成α-4贾第素抗原肽,与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫新西兰白兔,Protein A亲和层析纯化抗血清,采用α-4贾第素重组蛋白和贾第虫滋养体全虫体裂解物通过Western blot验证抗血清结合力和结合特异性,选择高特异性抗体通过免疫胶体金电镜观察α-4贾第素的亚细胞定位. 结果 筛选出3段可能的抗原肽,合成的抗原肽与KLH偶联后免疫兔得到高效价抗血清,Protein A纯化效果良好;3种纯化抗血清均能与α-4贾第素结合,其中anti-P2具有较高的抗原结合特异性.采用anti-P2进行免疫胶体金电镜,显示α-4贾第素主要定位于鞭毛,胞浆也有少量散在表达. 结论 制备的α-4贾第素多克隆抗体具有抗原结合特异性.用anti-P2进行免疫胶体金电镜,α-4贾第素主要定位于贾第虫鞭毛.
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基于加权模糊k近邻方法的蛋白质亚细胞位点预测
蛋白质只有在特定的亚细胞位点(如细胞核、线粒体、细胞质等)才能参与正常的生命活动,因此蛋白质的亚细胞定位信息对于了解其功能有重要的意义.提出一种应用于蛋白亚细胞定位的多模糊k近邻加权投票算法.使用PSI-BLAST搜索得到的PSSM矩阵,以及1～7阶氨基酸对的信息作为输入特征,分别建立了8个模糊k近邻分类器,后对所有分类器的结果使用加权投票得到终预测结果.对包含四类亚细胞位置的RH-2427数据集进行jacknife测试,总预测精度达到88.1%,好于包括单一模糊k近邻在内的多种其它预测方法.同时,该方法可以方便地扩展到对包含叶绿体、高尔基体、溶酶体等更多类亚细胞位点的预测.
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共刺激分子B7-H1、B7-H3和B7-H4在血液系统恶性肿瘤细胞株中的表达水平和分布特征
目的:探讨3种共刺激分子B7-H1、B7-H3和B7-H4在人类血液系统恶性肿瘤细胞株中的表达及分布特征.方法:分别采用RT-PCR、qPCR、Western blot和流式细胞术检测13株血液肿瘤细胞中B7-H1、B7-H3和B7-H4的表达及亚细胞定位情况,设12例志愿者外周血单个核细胞(PB MNC)为对照.结果:3种共刺激分子的mRNA在12例志愿者PB MNC和13株血液肿瘤细胞中广泛表达,其中B7-H4表达水平相对偏低;3种共刺激分子分别在Maver、Z138和HL-60中表达高,B7-H3和B7-H4在CZ1中不表达.3种共刺激分子的胞核及胞浆蛋白仅在恶性血液肿瘤细胞中异常高表达,分别在U937、Z138和Raji细胞中表达高,B7-H3和B7-H4在CZ1细胞中不表达.在同一肿瘤来源的细胞株中,3种共刺激分子的mRNA和胞核及胞浆蛋白表达均存在差异,且差异不全一致.B7-H3膜蛋白在U937、Maver和Z138中表达丰度较高;B7-H1和B7-H4的膜蛋白在13株细胞中呈不表达或低表达.结论:共刺激分子B7-H1、B7-H3和B7-H4在mRNA水平均广泛表达,但蛋白水平仅在血液肿瘤细胞中异常高表达,且亚细胞定位多在胞核及胞浆,膜蛋白水平普遍低表达或不表达.同一肿瘤来源的细胞株中3种共刺激分子的表达可存在差异.
