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鸭瘟病毒UL35基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主中的亚细胞定位
根据本实验室获得的鸭瘟病毒(DPV)UL35基因序列(GenBank登录号:EF643558),利用Oligo6.0和Primer5.0软件设计一对引物,PCR扩增出DPV CHv强毒株UL35基因,随后将其克隆至pMD18-T构建克隆质粒pMD18-T-UL35,经PCR和酶切鉴定后亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+),获得表达质粒pET-32a (+)-UL35后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经1.0mmol/L的IPTG在34℃诱导5h获得佳表达.SDSPAGE分析表明UL35基因表达的重组蛋白(VP26)分子量约为33kD,薄层扫描分析结果显示VP26占菌体总蛋白的32.3%,主要以包涵体的形式存在.经Ni+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化后免疫家兔制备抗VP26重组蛋白血清,血清琼脂扩散试验抗体滴度检测结果达1:32.用High-Q阴离子交换层析纯化抗血清获得兔抗VP26重组蛋白IgG,经Western blot检测显示抗血清可与VP26发生特异性反应.通过免疫荧光技术进行DPV VP26亚细胞定位检测,结果表明DPV感染DEF后2～8h细胞核内荧光的量相对较少,12～36h逐渐增加,48～72h达到多,并且在细胞核内的斑点区域聚集呈颗粒状分布;而在细胞质内12h才开始出现少量荧光,荧光量在DPV感染后24～48h期间随感染时间延长而增加,在感染后72h多.以上结果为阐明和进一步开展DPV UL35基因的功能研究提供了重要数据和材料.
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鸭瘟重组病毒穿梭载体的构建及分析
目的 本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础.方法 选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP.在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化.结果 成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,pBlusecript Ⅱ SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用pUC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑.结论 拯救鸭瘟重组毒的研究中,pBlusecript Ⅱ SK载体可能不是佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区.
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鸭瘟病毒PCR检测方法的建立及验证
目的 建立鸭瘟病毒PCR检测方法,并进行验证.方法 根据GenBank中登录的鸭瘟病毒基因(UL30、UL31)序列,设计合成1对特异性引物,以鸡胚化弱毒疫苗株病毒基因组DNA为模板,进行PCR扩增.优化PCR的反应条件,并对方法的敏感性、特异性及适用性进行验证.结果 经PCR可扩增得到446 bp的目的基因条带,测序结果与已发表的序列同源性达100%.该方法的低检出限为2.1 pg,对7种鸭易感性病原体及3种鸭瘟病毒同类病原体的检测结果均为阴性.结论 已建立了敏感、特异、快速的鸭瘟病毒PCR检测方法.
