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鸭瘟重组病毒穿梭载体的构建及分析
目的 本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础.方法 选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP.在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化.结果 成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,pBlusecript Ⅱ SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用pUC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑.结论 拯救鸭瘟重组毒的研究中,pBlusecript Ⅱ SK载体可能不是佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区.
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Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化
目的 筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性.方法 将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别；病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化；免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态.结果 在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID5o/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因；病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常.结论 成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性.
