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伯氏疏螺旋体活体成像动物模型穿梭载体的构建
莱姆病是由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi,又称莱姆病螺旋体)引起的重要的动物疫源性疾病.伯氏疏螺旋体的分子遗传学研究缺乏相关载体,遗传学转化异常困难,因此对于伯氏疏螺旋体致病因子的研究进展缓慢.
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利用Hsp基因调控元件构建胞内表达的E.coli-BCG穿梭载体
目的构建能够携带外源蛋白基因并能在胞内表达的E.coli-BCG (Bacille Calmette-Guerin)穿梭载体. 方法用多聚酶链式反应(PCR)从结核分枝杆菌毒株H37Rv基因中扩增出结核分枝杆菌热休克蛋白(Hsp)60 N端6个氨基酸及其上游调控元件基因,克隆入E.coli-BCG穿梭载体pOLYG中,以屋尘螨抗原(Der p2)为外源蛋白,用间接免疫荧光染色法观察该载体介导的Der p2基因在牡牛分枝杆菌(M.vaccae)宿主中的表达. 结果经测序证实所克隆的Hsp60ss基因序列正确,所构建的胞浆内表达E.coli-BCG穿梭载体(pIC)能完成在大肠杆菌和M.vaccae细胞之间的穿梭,并介导抗生素抗性基因的表达,经免疫荧光检查外源基因Der p2可表达于M.vaccae宿主胞内,并受到培养温度的调节. 结论成功构建了在M.vaccae胞内表达外源蛋白的E.coli-BCG穿梭载体.
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一种伯氏疏螺旋体表达质粒的构建
目的 构建一个具有较强遗传可操作性的大肠杆菌-伯氏疏螺旋体表达穿梭质粒,以期作为工具质粒在疏螺旋体中实现外源基因的可诱导表达.方法 利用源自大肠杆菌的lac表达/诱导系统,在已有的穿梭质粒的基础上,通过分子生物学技术加入多克隆位点和HA、FLAG蛋白表达标签,增加其遗传可操作性.结果 成功构建工具质粒pJ J275,可以用于伯氏疏螺旋体的基因可控制表达.以rpoS基因为例,将其克隆至pJJ275并转入疏螺旋体中,获得的菌株在IPTG存在的条件下可诱导表达目的蛋白RpoS及其控制下的OspC.结论 构建的工具质粒易于分子生物学操作,可以实现疏螺旋体中外源基因的可控制表达.
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鸭瘟重组病毒穿梭载体的构建及分析
目的 本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础.方法 选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP.在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化.结果 成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,pBlusecript Ⅱ SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用pUC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑.结论 拯救鸭瘟重组毒的研究中,pBlusecript Ⅱ SK载体可能不是佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区.
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乙肝病毒前S1基因与截短C基因穿梭表达载体构建
目的构建HBV前S1基因和截短C基因分泌型大肠杆菌和分枝杆菌穿梭质粒.方法以含HBV基因组质粒pCP10序列为模板,PCR扩增前S1基因和C基因截短片段,依次克隆至分泌型穿梭表达载体pDE22,电穿孔转化法将重组质粒导入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆热休克诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析.结果扩增到了预期长度的2个目的基因,构建了分泌型穿梭载体,SDS-PAGE分析可见相对分子质量约23 000蛋白表达条带.结论已成功构建耻垢分枝杆菌分泌表达前S1基因和截短C基因的穿梭载体,为研究含前S基因和截短C基因的重组BCG疫苗奠定了基础.
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GFP为外源报告基因在地衣芽孢杆菌20386中表达的研究
目的探讨外源基因在野生型地衣芽孢杆菌20386中表达的可行性.方法利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体在大肠杆菌DH5a中构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒,通过电转化将重组质粒转入到野生型地衣芽孢杆菌20386中表达,通过检测绿色荧光蛋白的存在,考察该野生型菌株表达外源基因的可能性和表达能力.结果在紫外光激发下,在固体LB平板上生长的菌落能显示绿色荧光,而在液体LB培养基中培养的菌体和培养上清中未能检测到绿色荧光蛋白的存在.结论外源基因在野生型地衣芽孢杆菌20386中能够表达,但在液体LB中培养时,可能会被该菌自身分泌的蛋白酶分解;亦可能被稀释而无法测到荧光,还需进一步研究.
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含人自噬基因hAPG12穿梭载体构建及其在酵母自噬中的作用
目的该研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,将构建好的载体转化到酵母菌内,以此研究hAPG12在酵母自噬过程中的作用.方法从pEGFP-C2-hApG12中扩增出EGFP-hAPG12融合基因,鉴定正确后定向亚克隆到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pESC-URA中,构建载体pESC-URA-EGFP-hAPG12并将其转化到酵母,荧光显微镜下观察,用自噬诱导剂诱导酵母自噬以观察hAPG12在酵母内的表达定位.结果证实EGFP-hAPG12基因已完全正确亚克隆到pESC-URA中,荧光显栽微镜观察结果证明EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中成功表达,以诱导培养24 h的荧光强,EGFP-hAPG12定位于酵母的自噬体中.结论成功构建了具有报告基因的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12;EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中得到表达,hAPG12在酵母自噬体形成过程中起作用.
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人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建
目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中.为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体.方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体.结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH.结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础.
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芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建
目的 构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的两种穿梭载体与上游强启动子.方法 将解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子克隆到载体pbluescript-sk(+)上,构建载体pBLKSP;以A16R疫苗株(Tox+,Cap-,弱毒株)DNA为模板,设计合成内外侧引物巢式PCR扩增获得保护性抗原(PA)的全基因,先克隆到载体pBLKSP,再将其和质粒PUB110重组构建成两种穿梭载体.结果 酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符.测序结果与文献报道序列及预计结果一致.结论 成功构建了带有强启动子的两种穿梭载体.为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定
目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定. 方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定.酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定.结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体. 结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础.
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腺病毒载体介导PDX1在人脐带间充质干细胞中的表达
目的 构建含胰十二指肠同源框-1基因（pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX1）的重组腺病毒载体，并检测其在人脐带间充质干细胞(human umblic cord msenchymal stem cells，HUCMSCs)的表达情况。方法 用BgⅢ/XhoI酶从pUC57-PDX1酶切PDX1，连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体，得到pShuttle-GFP-CMV-PDX1重组穿梭质粒，再将pShuttle-GFP-CMV-PDX1转移到pAdxsi载体上，得到pAdxsi-GFP-PDX1病毒质粒，利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞，包装出完整的腺病毒。用重组腺病毒感染HUCMSCs 24 h 后，经荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等检测PDXI基因及蛋白的表达。结果通过测序、酶切等鉴定PDXI基因正确插入穿梭质粒中，并与病毒骨架质粒重组，重组腺病毒可高效转染HUCMSCs，RT-PCR检测到PDXI mRNA在HUCMSCs中表达，经免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等证实转染PDXI在HUCMSCs胞核中表达。结论成功构建了PDX1腺病毒载体，并在HUCMSCs中有效表达。
关键词： 胰十二指肠同源框-1基因 间充质干细胞 穿梭载体 腺病毒载体
