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四川泡菜发酵过程中酵母菌的动态变化规律及分离鉴定
从四川泡菜中分离5株不同酵母菌，各株酵母菌有着不同的菌落特点，分离鉴定采用26SrDNAD1/D2区序列分析法，鉴定出1株膜璞毕赤酵母、4株酿酒酵母。检测结果表明，两种酵母菌都存在于四川泡菜发酵前期，随着时间的推移，不同泡菜两种酵母菌的变化各不相同。
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正交试验设计在优化酿酒酵母培养条件中的应用
本文以优化酿酒酵母培养条件为例,详细阐述了正交试验设计的应用过程,包括正交试验设计中的具体环节如:定指标、选因素、定水平、列因素水平表、选正交表等.具体采用了L9(33)正交表对影响酿酒酵母生长的关键因素:培养时间、培养温度和摇床转速进行了正交试验设计,同时详细阐述了如何对试验结果进行方差分析和极差分析.
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富硒酿酒酵母筛选及其富硒蛋白研究
酿酒酵母是运用于葡萄酒工业的一种主要的酵母菌。优质的葡萄酒生产，需要能够体现出当地葡萄酒的特色和风格。在我国，对本土的酵母资源的研究是进行酵母菌的选种和育种的基础条件。尤其是在我国的甘肃和宁夏地区这些重要的葡萄酒产地，是比较优质的生产葡萄酒的区域。因此，文章中的研究主要侧重于酿酒酵母的富硒筛选，再经过鉴定，了解到酿酒酵母是否具有耐受性。
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构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素
为构建高效生产番茄红素的酿酒酵母细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母中引入番茄红素生物合成途径基因CrtB和CrtI,获得能生产0.17 mg·L-1番茄红素的初始工程菌ZD-L-000.在此基础上,在工程菌ZD-L-000中分别过表达MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、萜类合成调控的转录因子编码基因upc2.1、二萜生物合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与法呢基焦磷酸合酶编码基因BTS1-ERG20,以及来自嗜酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因SaGGPS,考察这些基因过表达对番茄红素合成的影响,结果发现过表达upc2.1基因未能提高番茄红素的产量,但过表达tHMG1、BTS1-EGR20和SaGGPS基因均能显著提高番茄红素的产量,分别为初始菌株的2.0,16.9和20.5倍.在进一步研究中,tHMG1、BTS1-EGR20和SaGGPS等有效基因被一同整合入工程菌ZD-L-000,获得的高产菌株ZD-L-201中番茄红素的产量提高77.0倍,达到13.23 mg·L-1;在高密度-两相发酵体系中工程菌ZD-L-201的番茄红素产量能进一步提高到135.21 mg·L-1(提高10.2倍).本研究获得的工程菌为微生物发酵法生产番茄红素提供了基础.
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创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇
羽扇豆醇、桦木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗肿瘤等多种生物学活性,其中羽扇豆醇为这类化合物的基本前体.为了实现羽扇豆烷型三萜的异源发酵法生产,研究首先运用高通量同源重组法在酿酒酵母中进行萜类甲羟戊酸(MVA)途径的一步法调控,以提高三萜通用前体鲨烯的供给;在进一步工作中,拟南芥来源的羽扇豆醇合成酶基因(AtLUP)被整入三萜底盘菌株中实现羽扇豆醇酵母人工细胞工厂的创建.结果表明该实验能一次完成MVA途径的7个基因的整合,组装总长度达到20kb,同时多倍化MVA途径能显著提高鲨烯产量约500倍,达到354.00 mg·L-1;AtLUP基因在染色体上整合后获得的工程菌NK2-LUP在摇瓶中发酵能生产8.23 mg·L-1羽扇豆醇.该研究可为在酵母中实施大规模生物合成途径组装提供技术支持,同时为进一步获高产羽扇豆烷型三萜的人工酵母细胞提供了重要基础.
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齐墩果酸酵母细胞工厂的合成途径与发酵工艺优化
目的:通过遗传改造和发酵工艺优化等方法进一步提高齐墩果酸酿酒酵母细胞工厂的生产能力.方法:利用多片段基因同源重组法,增加齐墩果酸酿酒酵母工程菌BY-OA中甘草β-香树脂合酶(GgbAS),蒺藜苜蓿齐墩果酸合成酶(MtOAS)和拟南芥烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶1(AtCPR1)等基因的拷贝数;并通过优化YPD发酵液中初糖浓度的方式提高齐墩果酸的产量.结果:增加工程菌BY-OA中GgbAS,MtOAS和AtCPR1基因的拷贝数能显著提高工程菌中目标产物的产量,获得的工程菌BY-2OA在初始葡萄糖浓度为20g·L-1的YPD培养基中发酵7d后β-香树脂和齐墩果酸分别达到136.5 mg·L-1(提高54％)和92.5 mg·L-1(提高30％),当初糖浓度提高到40g·L-1时,齐墩果酸产量能达到165.7 mg·L-1.结论:新获得的工程菌BY-2OA生产齐墩果酸的能力显著提高,为发酵法生产齐墩果酸奠定了基础.
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高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建
橙花叔醇为萜类精油成分,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性.为了实现在酿酒酵母中异源生产橙花叔醇,该研究首先将猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶(NES)基因通过密码子优化、人工合成后转入底盘菌株FPP-001中获得工程菌株NES-001,其橙花叔醇产量达到2.71 mg·L-1.在进一步工作中,橙花叔醇合酶的N端通过连接肽GGGS 融合法尼烯合酶(FPS)后得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES-002,其产量是NES-001的59.80倍,达到162.07 mg·L-1.终,通过恢复NES-002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES-003,该菌在高密度发酵体系中橙花叔醇产量能达到1 711.53 mg·L-1.该研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础.
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葫芦二烯醇的异源高效合成研究
葫芦二烯醇具有抑制炎症和抗癌活性,同时为罗汉果甜苷和葫芦素等重要中药有效成分生物合成途径中的基本前体.为获得高效生产葫芦二烯醇的酿酒酵母细胞工厂,该研究首先从罗汉果中克隆到葫芦二烯醇合酶(CBS)基因,通过在三萜化合物底盘菌WD-2091中异源表达和发酵后,产物经过GC-MS鉴定获得产量为27.44 mg·L-1工程菌.再进一步调控工程菌中葫芦二烯醇合酶基因表达,终成功获得葫芦二烯醇提高202.07%,产量为82.89 mg·L-1,高密度发酵达到1 724.10 mg·L-1的酿酒酵母细胞工厂313-SL-CB.该研究为推动葫芦烷型四环三萜生物合成途径解析及高效细胞工厂创建提供了基础.
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用酿酒酵母全基因组DNA芯片研究盐酸小檗碱的药理作用机制
目的:利用自己构建的酿酒酵母全基因组DNA芯片,分析盐酸小檗碱处理酵母细胞后对其整个基因表达谱的影响,在基因水平上分析盐酸小檗碱的药理机制.方法:用盐酸小檗碱(100μg/ml)处理酵母细胞90min后,抽提细胞的RNA进行反转录荧光标记cDNA,与DNA芯片进行杂交.用激光扫描仪检测杂交信号.结果:共有545个基因[占全部基因(6183个)的9%]受到诱导,38个基因(占全部基因的0.6%)受到抑制.被诱导的基因包括与细胞生长、蛋白质合成及应激反应相关的基因.受抑制的基因包括与氧化磷酸化过程相关的基因和好氧基因.与金属离子平衡,特别是与铁离子和铜离子平衡有关的基因表达有较大变化.结论:处理90min后,酵母细胞在转录水平上表现出对盐酸小檗碱处理的适应性.盐酸小檗碱的药理作用可能和引起细胞内的氧浓度变化及氧化还原反应产生的自由基有关.细胞容易对盐酸小檗碱产生抗药性的原因是由于与细胞抗药性相关的基因受到了明显的诱导.
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乙肝疫苗问题调查结果公布深圳康泰疫苗恢复使用
国家食品药品监管总局和国家卫生计生委对深圳康泰生物制品股份有限公司及其所生产的重组乙型肝炎疫苗展开全面调查。根据现场检查报告、产品抽验结果、质量回顾分析以及病例调查诊断等情况，未发现深圳康泰生物制品股份有限公司生产的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）存在质量问题。1月17日，国家食品药品监管总局和国家卫生计生委联合发出通知，决定恢复深圳康泰生物制品股份有限公司重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）的使用。
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钙调蛋白基因缺陷TRP1酿酒酵母菌株的构建和鉴定
目的构建钙调蛋白基因(CMD1)缺陷TRP1酵母菌株,为探讨钙调蛋白功能性基团对真菌致病性的影响打下基础. 方法通过基因等位置换,筛选产生cmd1::TRP1置换的YPH501菌株,并转入含CMD1序列的质粒Ⅱ.减数分裂后经省却Trp/Ura培养基选择得到发生cmd1::TRP1置换的酵母菌单倍体菌株. 结果 Southern blot证实了cmd1::TRP1基因置换,经省却Trp/Ura培养基选择得到了带有TRP1序列的酵母菌单倍体菌株. 结论成功构建了钙调蛋白基因缺陷TRP1酿酒酵母菌株,为后续研究打下了基础.
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酿酒酵母细胞GUT2基因的研究进展
目的 一磷酸甘油脱氢酶(glycerol-1-phosphate dehydrogenase,GPD)是广泛存在于微生物、动物和植物中的一类重要代谢酶,参与能量代谢、磷酸合成等生物过程.酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞中存在3种GPD的同工酶,其中有两种以NAD为辅基并定位于胞质中,分别由GPD1和GPD2基因编码形成;还有一种GPD同工酶以FAD为辅基,由GUT2基因编码形成,定位于线粒体,参与细胞的甘油代谢[1].GUT2基因是酿酒酵母细胞中线粒体FAD+-3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因.在甘油分解代谢中,该酶催化3-磷酸甘油转化成为磷酸二羟丙酮.同时还发现,GUT2基因是一个全新的线粒体内膜肽酶IMP的酶作用物.在工业生产中,通过敲除GUT2基因构建高产菌株可用于提高甘油产量.本文从GUT2基因的生物学功能研究与工业生产应用展开论述.
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在酵母中异源表达人破骨细胞钠氢转运蛋白
目的 在酿酒酵母中异源表达人破骨细胞分化成熟潜在因子钠氢转运蛋白2(HsNHA2),鉴定其作为盐离子载体转运Na+的功能,并对其在细胞中的表达进行初步定位分析.方法 采用高保真PCR试剂盒扩增出HsNHA2；构建酵母表达载体,通过电穿孔的方式转入到酿酒酵母菌株中；Western印迹检测其在酵母菌株的表达；通过NaCl选择压力观察菌株在高盐环境中的生长表型,并用根皮素抑制HsNHA2观察其抗盐功能；后用细胞原位荧光染色确定HsNHA2在细胞中的表达位置.结果 Western印迹证实HsNHA2在酵母菌株中正常表达；生长曲线显示HsNHA2可使菌株在高盐环境中生长,根皮素抑制HsNHA2表达后菌株不能在0.2mol/L NaCl培养基中生长；免疫荧光染色初步证明HsNHA2表达在细胞膜上.结论 HsNHA2作为盐离子载体在酵母细胞中主要表达在细胞膜上行使转运Na+的功能,以维持细胞正常生长.
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全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究
目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL/6小鼠.ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答水平.结果 全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7 蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16 -E7蛋白免疫(P<0.01).结论 全酵母疫苗既能表达HPV16-E7 蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答.研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础.
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鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定
目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗.方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6-mTn-3xHA/lacZ转座文库质粒中,将此重组质粒经Not I酶切线性化,然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组,再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选.结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定,证明其为重组阳性转化子.结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统,用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件.
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载鲑鱼降钙素新型重组酿酒酵母的降血钙活性研究
目的 研究表达鲑鱼降钙素(sCT)基因的表面展示型酿酒酵母经口服给药后对Wistar大鼠血清钙含量的影响.方法 鲑鱼降钙素基因克隆到表面展示型载体pYD1,LiAC法转化酿酒酵母EBY100菌株后获得转化子yAGA2-sCT.在荧光显微镜下检测FITC标记的转基凶酵母重组鲑鱼降钙素的表达情况.载鲑鱼降钙素重组酿酒酵母经冷冻干燥处理后分别以0.1、0.5g/kg和5g/kg浓度灌喂Wlstar大鼠,分别列入低、中、高剂量实验组(n=6);另设阳性药物组(皮下注射200mU/kg的密钙息,n=6))和2个条件对照组(分别灌喂5g/kg冷冻干燥的yAGA2-V5菌株和30μg的密钙息,n=6).眼球丛静脉毛细采血管取血后测定血钙值.结果 荧光显微镜下观察到重组酿酒酵母yAGA2-sCT成功表达了sCT蛋白.载鲑鱼降钙素重组酿酒酵母对大鼠的降血钙活性呈现剂量效应,实验组3个不同剂量的亚组中,高剂量组5g/kg载鲑鱼降钙素酵母yAGA2-sCT的降血钙活性为显著(P<0.01),且在第2h时降血钙效应达到大.口服5g/kg的yAGA2-sCT的高剂量组在2h之后,大鼠血钙值从2.685±0.023mmol/L 降低到2.355±0.012mmol/L.结论 5g/kg的载鲑鱼降钙素酵母yAGA2-sCT能明显降低血钙值,是实现鲑鱼降钙素口服的一种可能的新途径.
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转化次丹参酮二烯酿酒酵母全细胞催化体系的构建
丹参酮是中药丹参的重要活性成分之一,其代谢途径尚未明确.快速筛选和鉴定丹参酮生物合成途径相关基因具有重要意义.铁锈醇作为丹参酮代谢途径中间产物,其产量相对较低,为得到大量铁锈醇用来作为下游P450功能鉴定的底物进行下游途径解析,迫切需要建立高效转化次丹参酮二烯至铁锈醇的体系.本文以酿酒酵母为宿主,构建了含有催化次丹参酮二烯生成铁锈醇的CYP76AH1及P450还原酶SmCPR1全细胞催化体系,并在DNA及mRNA水平对其进行了表征.通过透性剂处理,实现了一步生物转化合成铁锈醇,转化效率达到了69.9％.该研究证实含有CYP76AHl及来源于丹参的细胞色素还原酶SmCPR1的酿酒酵母能够将次丹参酮二烯转化为铁锈醇,研究结果不仅为生物转化生产铁锈醇提供了一个有效平台,还可以用于鉴定丹参酮下游合成的其他CYP450的功能.
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利用反义RNA技术抑制酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因的表达
羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点,下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢途径可促进其流向三萜类化合物的代谢途径.有鉴于此,本研究根据酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列设计引物,扩增5’长片段(包括erg7基因5'非编码区启动子序列和部分编码区序列)、5’短片段(包括erg7基因5’非编码区部分启动子序列和部分编码区序列)和erg7基因编码区片段,分别将其反向克隆到表达载体pESC-URA上,构建反义表达质粒.用反义表达质粒转化酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-URA上筛选重组菌株.通过半定量PCR进行检测,结果表明:与INVScl相比,转入erg7基因编码区反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量没有显著变化,而转入5'长反义片段和5'短反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量明显降低.通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与INVSc1相比,转入5’短反义片段和erg7基因编码区反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量没有显著变化,而转入5’长反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量明显降低.本研究利用反义RNA技术抑制酿酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表达,为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物代谢途径奠定了基础.
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人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶在酿酒酵母中的表达、定位及功能研究
为了研究人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶(dammarenediol-Ⅱ synthase,DS)在酿酒酵母中的重组表达和定位,本研究克隆了人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds,并将其与绿色荧光蛋白基因gfp融合,构建了相应的重组表达质粒pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP,转化酿酒酵母INVSc1,获得了重组菌INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP.通过差速离心法制备重组菌微粒体,荧光显微镜下观察达玛烯二醇-Ⅱ合酶的表达及亚细胞定位,并通过酶促反应对该酶进行了功能鉴定,结果表明,DS为膜结合型蛋白,在体外能催化2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-Ⅱ.对重组菌发酵产物进行分析,结果表明,重组菌中产生了达玛烯二醇-Ⅱ,且通过将ds与gfp融合,重组菌中的达玛烯二醇-Ⅱ产量由7.53 mg·g-1提高到12.24 mg·g-1,该结果为优化在酿酒酵母中构建的人参皂苷代谢途径提供了新思路.
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一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用
天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构.启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用.为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建.首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达.然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red.为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率.结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达.该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础.
