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首例入境集装箱中发现疑似鼠疫感染死鼠的检测
目的:通过对入境集装箱中发现的死鼠进行实验室检测,加强叫岸对入境啮齿动物携带鼠疫杆菌的监测力度.方法:分别用胶体金和PCR方法对入境集装箱中发现的死鼠进行鼠疫杆菌检测.结果:该样本鼠疫杆菌F1抗原阳性,pla基因和fra基因PCR扩增均为阳性,判定该样本为疑似鼠疫杆菌感染.结论:在口岸一线加强对入境鼠类携带鼠疫杆菌检测具有重要意义.同时,应不断加强口岸公共卫生核心能力建没,加强公共卫生实验室建没及重大疫情检测技术储备.
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双抗原夹心ELISA检测鼠疫F1抗体技术的应用
目的 研究双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)检测鼠疫F1抗体技术在鼠疫监测中的实用性.方法 用DAgS-ELISA和间接血球凝集试验(IHA)微量法对比检测558份标本鼠疫F1抗体.结果 IHA检测出阳性33份,DAgS-ELISA检出阳性31份,阳性符合率为90.91%,阴性符合率99.81%,总符合率99.28%,二者检出阳性率分别为5.91%和5.56%,差异无统计学意义(X2=0.25,P=0.625).2种方法测定27份鼠疫免疫血清均阳性,IHA微量法的敏感性高于DAgS-ELISA(t=3.023,P=0.006).结论 DAgS-ELISA检测鼠疫F1抗体敏感性低于IHA微量法,但特异性好,无前滞反应,可避免初筛漏检问题.
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鼠疫菌caf1基因特异性片段的克隆表达及其抗原与抗体反应
目的 克隆表达鼠疫菌caf1基因上的特异性片段并检测.方法 分别选取F1上C端(caf1-C)及N端(caf1-N)两段B细胞表位进行克隆表达;PCR扩增目的基因,并与表达质粒pET32a(+)进行连接,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)并诱导表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并以Western-blot法检测其抗原与抗体反应.结果 分别诱导表达出大小为26000的Caf1-C和25000的Caf1-N两个片段,2个重组蛋白均以可溶形式存在,并与鼠疫免疫血清有良好的反应.结论 克隆表达出具有抗原与抗体反应的鼠疫菌F1抗原上的两段B细胞表位,为鉴定是否是F1位点交叉奠定了基础.
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鼠疫耶尔森菌的多重PCR检测方法
目的 研究一种快速、特异的检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的多重聚合酶链反应(PCR)方法.方法 选用针对鼠疫菌F1抗原基因、pla基因、inv基因和一段鼠疫特异染色体序列设计的4对引物,以鼠疫菌及其他肠道致病菌DNA为模板并加入内部对照模板,在同一扩增体系中进行PCR扩增.结果 鼠疫菌DNA模板可扩增出预期产物,而其他菌株只能扩增出内部对照模板的片段.结论 多重PCR方法具有较高的特异性.可迅速、有效地将鼠疫菌与其他肠道致病菌相鉴别,也可应用于鼠疫监测.
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鼠疫组分疫苗诱导小鼠体液免疫应答研究
目的 通过检测鼠疫组分疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答,对其免疫原性进行评价.方法 将小鼠随机分成4个实验组,免疫后5周内眦采血,检测血清中抗F1抗原和rV抗原IgG及IgA抗体；充分暴露气管,沿气管上端剪一楔形口,用PBS冲洗肺泡制备肺冲洗液,检测肺冲洗液中抗F1抗原和rV抗原IgG及IgA抗体.结果 血清中可产生较高效价的抗F1抗原和rV抗原IgG抗体以及较低效价的抗F1抗原IgA抗体.肺冲洗液中可检测到抗F1抗原和rV抗原的IgG抗体,但无特异性IgA产生.结论 鼠疫组分疫苗能诱导小鼠产生较强的血清抗体应答,肺冲洗液可检测到一定的IgG抗体,该疫苗有希望成为我国新一代鼠疫疫苗.
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鼠疫耶尔森菌F1抗原的纯化方法改进及其免疫原性的评价
目的 建立从减毒鼠疫菌培养物中提取天然F1抗原的方法,评价F1抗原对鼠疫的免疫保护效果.方法 通过用玻璃珠裂解菌体替代有机溶剂的方法,结合饱和硫酸铵沉淀和凝胶过滤的方法从鼠疫菌培养物中纯化出天然F1抗原.将F1抗原吸附到25%氢氧化铝佐剂中,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,于初次免疫后第18周皮下攻毒104 CFU活鼠疫菌141强毒株.结果 一次免疫的两个剂量组之间产生的抗体滴度差异无统计学意义,而加强免疫的两个剂量组中,F1-40 μg剂量组产生的抗体滴度明显高于F1-20μg剂量组.F1抗原免疫的小鼠全部存活,而且健康状况良好,对照组小鼠全部死亡.结论 本研究提供了一种简单、有效和便于大规模提取F1抗原的方法.提取的F1抗原具有较高的免疫原性,可作为鼠疫亚单位疫苗的重要抗原组分用于鼠疫亚单位疫苗的研制.
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鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定
目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗.方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6-mTn-3xHA/lacZ转座文库质粒中,将此重组质粒经Not I酶切线性化,然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组,再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选.结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定,证明其为重组阳性转化子.结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统,用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件.
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大肠杆菌htrA突变株构建及其在鼠疫拟菌颗粒疫苗制备中的应用
目的 基于乳酸乳球菌和鼠疫耶尔森菌F1抗原,制备鼠疫拟菌颗粒疫苗.方法 基于λ-Red一步重组技术,构建BL-21大肠杆菌htrA基因缺失突变株;将鼠疫菌F1抗原基因和PA基因克隆至pET-28 a(+)质粒中构建F1-PA融合蛋白表达载体,将此载体分别导入到BL-21大肠杆菌野生株和其htrA基因缺失突变株中构建F1-PA融合蛋白表达菌株;SDS-PAGE电泳分析F1-PA融合蛋白表达;镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白,梯度稀释透析法复性F1-PA融合蛋白;乳酸乳球菌经热酸处理制备拟菌颗粒;革兰染色和透射电镜分析拟菌颗粒的形态;拟菌颗粒分别与F1-PA融合蛋白或F1蛋白共孵育制备拟菌颗粒疫苗.结果 F1-PA融合蛋白在大肠杆菌野生株和htrA缺失突变株中均以包涵体形式表达.拟菌颗粒对F1-Pa融合蛋白的吸附能力明显高于对F1蛋白的吸附能力.F1-PA融合蛋白在大肠杆菌htrA突变株中的表达量明显高于在野生株中的表达量.结论 大肠杆菌htrA突变株用于表达F1-PA融合蛋白优于野生株.借助于肽聚糖锚钩蛋白,可将鼠疫菌F1抗原结合到乳酸乳球菌拟菌颗粒上制备鼠疫拟菌颗粒疫苗.
关键词： 乳酸乳球菌 拟菌颗粒疫苗 鼠疫耶尔森菌 F1抗原 大肠杆菌htrA突变株 -
鼠疫疫苗的研究现状和进展
目的 对鼠疫疫苗的研究进展进行综述,为新型鼠疫疫苗的研究和应用提供参考.方法 通过查阅近年来与鼠疫疫苗有效性和安全性研究相关的国内外文献,进行归纳总结.结果与结论 现有鼠疫疫苗因其在保护力和安全性方面的限制,需要开发更为安全有效的新型鼠疫疫苗.鼠疫亚单位疫苗、DNA疫苗和应用新佐剂及改变接种途径的鼠疫疫苗等是目前和今后一段时间内的研究热点.对鼠疫菌候选抗原的研究是鼠疫亚单位疫苗研究的基础.新型鼠疫疫苗对增加使用者依从性、提高疫苗免疫效果和安全性具有重要意义.
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鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证
目的 检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性.方法 针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品.结果 基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性.结论 在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性.
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鼠疫耶尔森菌F1抗原蛋白大肠杆菌分泌表达载体的构建
目的 构建鼠疫耶尔森菌F1抗原蛋白的大肠杆菌分泌表达载体.方法 PCR法扩增鼠疫耶尔森菌的F1抗原基因,并插入大肠杆菌分泌表达载体pBAD/gⅢC中构建分泌表达载体.结果 扩增出了长约500 bp的鼠疫耶尔森菌F1抗原基因并构建了该抗原的大肠杆菌分泌表达载体.结论 本研究中我们用载体pBAD/gⅢC构建鼠疫耶尔森菌F1抗原的大肠杆菌分泌表达质粒,为后期制备针对鼠疫F1抗原的单克隆抗体或多克隆抗体,进一步建立便捷高效的鼠疫诊断方法奠定基础.
关键词： 鼠疫耶尔森菌 鼠疫 F1抗原 pBAD/gⅢC载体 -
PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因
目的 应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因.方法 应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验.结果 该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的 扩增带.结论 该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验.
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鼠疫组分疫苗F1抗原、rV抗原含量的检测及其质量控制
目的 采用双抗体夹心ELISA法检测鼠疫组分疫苗中F1和rV的抗原含量.方法 利用F1、rV抗原单克隆抗体,对鼠疫组分疫苗原液进行抗原鉴别试验；分别应用F1、rV抗原双抗体夹心ELISA法对疫苗原液进行抗原定量检测；验证Al(OH)3佐剂吸附抗原的完全性；将疫苗成品于4℃放置18个月,分别于1和18个月时取样,用建立的双抗体夹心ELISA法检测F1和rV抗原含量,分析抗原的稳定性；对3批鼠疫菌rV抗原原液3步纯化工艺进行验证.结果 鼠疫组分疫苗原液中的F1和rV抗原具有良好的反应原性；用建立的双抗体夹心ELISA法检测4批F1和rV抗原原液中F1和rV抗原的含量与Lowry 法检测结果的误差均在±20％以内；4批鼠疫组分疫苗离心后的上清液中均未检测到F1和rV抗原,表明Al(OH)3佐剂吸附抗原完全；4℃保存18个月,疫苗中的F1和rV抗原含量稳定；3批鼠疫菌rV抗原原液经阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析3步纯化,rV抗原在纯度增加的同时,抗原含量也增加.结论 已建立的F1、rV抗原双抗体夹心ELISA法可用于鼠疫组分疫苗中F1和rV抗原的定量检测.
关键词： 鼠疫组分疫苗 F1抗原 rV抗原 双抗体夹心ELISA法 -
鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒的研制
目的 研制鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证.方法 用鼠疫菌F1抗原免疫家兔制备抗血清,经50％饱和硫酸铵盐析2次后,再经Sephacryl S-300凝胶柱层析纯化,作为包被抗体;制备鼠疫菌F1抗原单克隆抗体腹水,并进行纯化,用HRP标记单抗,作为酶标抗体;建立鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品.对试剂盒进行板内板间精密性、灵敏度、线性范围、特异性、重复性、准确性和稳定性验证.结果 制备的试剂盒检测精密性参比品的板内变异系数为5.2％,板间变异系数为8.23％;试剂盒的线性范围为3.91 ～ 62.5 ng/ml,低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54％～8.4％,回收率在104％～108％之间;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年.结论 成功制备了鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,为鼠疫的临床诊断及流行病学监测提供了一种快速检测手段,也为新型鼠疫组分疫苗F1抗原含量的检测提供了方法.
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鼠疫耶尔森菌F1抗原免疫Balb/c小鼠方法的研究
目的 观察鼠疫耶尔森菌F1抗原(F1Ag)单克隆抗体制备过程中,F1Ag免疫Balb/c小鼠的免疫剂量和方法,探索操作性强、用时短和免疫效果好的方法.方法 7～9周龄Balb/c小鼠48只,按体质量随机分成6组:150、100、50、25μg组(第1次接种为皮下多点注射,F1Ag分别为150、100、50、25μg,第2、3次接种分别为皮下多点注射和腹腔注射,F1Ag量均为100 μg)、皮下接种组(3次F1Ag接种均采用皮下多点注射,每次100 μg)、腹腔接种组(3次F1Ag接种均采用腹腔注射,每次100 μg),每组8只.首次免疫接种F1Ag+等量弗氏完全佐剂(CFA)的乳化剂;3周后第2次接种F1Ag+等量弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂;1周后第3次接种F1Ag(不加佐剂);1周后取小鼠尾血,用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)微量法检测F1抗体.结果 不同剂量(150、100、50、25μg)组小鼠血清F1抗体效价(DAgS--ELISA法:G=12 173.87、13 440.37、15 024.19、4466.72;IHA微量法:G=19 972.32、18 089.40、23 170.47、4871.08)比较,差异有统计学意义(DAgS-ELISA法:F=3.11,P<0.05;IHA微量法:F=4.11,P<0.05).150、100、50 μg组小鼠血清F1抗体效价明显高于25μg组(DAgS-ELISA法:t值分别为2.18、2.39、2.73,P<0.05;IHA法:t值分别为2.54、2.73、3.13,P<0.05).不同接种途径条件下,皮下注射组、腹腔接种组、100μg组小鼠血清F1抗体效价呈渐次增高趋势(DAgS-ELISA法:G=8933.44、9986.16、13 440.37:IHA微量法:G=13 777.25、16 384.00、18 089.40),但差异无统计学意义(F值分别为0.66、0.25,P>0.05).结论 F1Ag免疫小鼠首次皮下多点注射50μg,加强免疫(腹腔注射)100μg,可以缩短整个免疫周期,免疫效果良好,抗体水平较高.
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胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗体技术的应用及效果评价
目的 研究鼠疫胶体金免疫层析法(GICA)快速检测鼠疫F1抗体技术在鼠疫血清学诊断、监测及流行病学调查中的应用及效果评价.方法 应用GICA、双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)对比检测190份啮齿动物血清和11份鼠疫免疫血清中鼠疫F1抗体.结果 190份动物血清IHA检测结果均为阴性;GICA检测出1份阳性血清,滴度1∶10;DAgS-ELISA检测出3份阳性血清,滴度1∶4(++)2份和1∶16(+)1份.3种方法检测11份鼠疫免疫血清均为9份阳性,但GICA敏感性低于IHA和DAgS-ELISA(GICA与IHA:t=3.257,P＜0.05;GICA与ELISA:t=3.625,P＜0.01;IHA与ELISA:t=1.437,P＞0.05).201份血清检测结果,GICA与IHA总符合率99.50%,与DAgS-ELISA总符合率99.00%,3种方法检测结果差异无统计学意义(χ2=0.5,P＞0.05).结论 GICA检测鼠疫F1抗体敏感特异、简便快速,与DAgS-ELISA同样为鼠疫血清学快速诊断和鼠疫监测中有应用价值的检测技术.
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辣根过氧化物酶标记不同表型鼠疫F1单克隆抗体的效果观察
目的 观察用辣根过氧化物酶(HRP)标记4种鼠疫F1抗体的效果.方法 使用过碘酸钠改良法制备酶结合物,酶标抗体的效价和适工作浓度用双抗体夹心法测定.结果 3株鼠疫F1单克隆抗体中B12标记成功;鼠疫γ球蛋白标记效果较鼠疫F1单克隆抗体B12差.结论 过碘酸钠改良法制备辣根过氧化物酶标记鼠疫F1单克隆抗体B12效果优于另外3种鼠疫F1抗体.
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分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立
目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株.方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SSP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆.结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定.结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序.
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鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测
目的 预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案.方法 采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean 软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测.结果 F1蛋白的B细胞表位可能位于第106～132和141～155等区域内.结论 预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立.
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胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体
目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法.方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对免、羊、人和黄鼠血清进行检测评价.结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份IHA临界阳性(滴度1:20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份.结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法.
